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overlap?pcr??重组PCR ????? 重组PCR的应用是非常广泛的，他的原理其实很简单：比如说有两个基因或者说一个启动子和一个基因，你要将他们连接到一起，我们首先想到的方法当然是借助于酶切的方法，但有时我们并不一定能构找到合适的酶切位点，或者说我们找到了酶切位点，但这种酶非常特殊或者又很贵，我们可能只用一次，这样购买酶就变成了一种浪费，难道没有别的办法了吗？当然有，那就是重组PCR技术。举个例子可能更容易说明。比如两个基因，一个命名为A，一个命名为B。A的序列为5-atgcatgctagctagaacgct acgctgactaccccctgatc-3，B的序列为5-atgctagtagctagccccc cccaggggataattttttaaaacg-3。首先我们要设计引物，假设引物的序列为： A1:5-ATGCATGCTAGCTAGAACGCT-3 A2:5-ggggggctagctactagcat gatcagggggtagtcagcgt-3 B1:5-acgctgactaccccctgatc atgctagtagctagcccccc-3 B2:5-cgttttaaaaaattatcccct-3 我们的目的是将基因A,B通过PCR的方法连接起来，我们可以仔细的观察上面的引物A2和B1，我们会发现这两条引物要比另外两条引物长很多，为什么会这样呢？这就是我们在设计引物的时候在A2的3端加入了20个B基因5端的序列，在B1的5端加入了20个A基因3端的序列。我们来看重组PCR的步骤： （1）以A1,A2扩增A基因，B1，B2扩增B基因 （2）回收A，B基因 （3）以A，B为共同的模板，A1和B2为引物，扩增A+B，这样我们就利用重组PCR的方法将A+B拼接起来了。为什么会扩出A＋B呢？因为我们在设计引物的时候使A，B有了20个互补的碱基，他们可以经过退火结合在一起，因此可以扩增出A+B. 第三步目前很多人的做法都不同，有的人是先加入模板A，B，dNTP，Buffer，水，然后进行3－5个循环的扩增，然后再加入引物A1和B2以及TAQ酶，这样做的好处是可以得到特异的扩增，缺点是麻烦。另外一种方法是将引物，双模板，酶，dntp等所有的反应成分均一起加入PCR管，进行反应，好处是节省时间，不太麻烦。 目前重组PCR的应用十分广泛，比如说在基因的定点突变，虽然说现在有很多的突变试剂盒，应用起来也很简单，但那是需要银子的；人工合成基因，其实人工合成基因最基本的技术（目前应用最为广泛的）就是利用重组PCR的方法；启动子与目的基因的串连；两个不同表达盒的连接，大家都知道我们在使用DNA调取或者说扩增基因的时候，往往需要将几个表达盒串连起来观察他们的表达效果，但由于绝大多数的DNA中都含有内含子，也就是说几个外显子并不是串连在一起的，而要想达到我们的目的，只要应用重组PCR技术就可以轻松完成。 以下是重叠延伸PCR的原理及两基因的引物设计： A基因： 上游（F1）与开放阅读框起始密码子附近的序列相对应，并在5 ’末端添加酶切位点和3个保护碱基；下游（R1）与B基因终止密码子附近的序列及A基因5’末端起始密码子附近的序列互补，并去除A B基因： 上游（F2）与A基因终止密码子附近的序列及B基因5 ’端起始密码子附近的序列相对应，同样去除A基因终止密码子TAA；下游（R2）与B基因的开放阅读框终止密码子序列互补，并在5