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流式细胞仪实验报告 　　流式细胞术　　实验目的　　掌握流式细胞仪的工作原理　　掌握用流式细胞仪测量细胞群体DNA含量分布的方法　　了解流式细胞术在细胞生物学研究中的应用　　实验原理　　流式细胞仪的工作原理是将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学特征。　　细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化，如G0/G1期的DNA含量为2C，而G2期的DNA含量是4C。利用PI标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。　　仪器、材料与试剂　　仪器：流式细胞仪、离心机。　　材料：Hela细胞样品、试管、离心管、封口膜、微量移液器、Tip头、Eppendorf管。试剂：70％乙醇，RNase，PI染液，PBS(pH，保存于4℃)　　实验步骤　　样品细胞由老师于课前收集并置于70%(预冷)乙醇中4℃下固定过夜。　　XXrpm15min收集固定细胞，PBS洗2次。　　用100μLPBS重悬细胞并转至试管中轻轻吹打。　　加PI染液50μL和RNase约2μL室温放置15min。　　上机检测。　　样品测定并使用ModFitLT软件分析结果。　　实验结果与讨论:　　所测样品中各周期时相的百分比：　　G1期%　　G2/M期%　　S期%　　G2：G1=1:　　CV提示结果可能不可靠或存在多倍体细胞。　　流式细胞术是一种对悬液中细胞、微生物或细胞器等进行单个快速识别、分析和分离的技术。用以分析细胞大小、细胞周期、DNA含量、细胞表面分子以及进行细胞分选等。这种技术具有以下特点1.测量速度快；2.可进行多参数测量；3.是一门综合性的高科技方法；4.既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。本次实验是通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，分析Hela细胞样本中各细胞周期时相所占的百分比。实验中所使用的Hela　　细胞应为对数生长期的细胞，因为这一期的细胞分裂活动最为旺盛，各个周期的细胞均有存在。　　流式细胞仪数据分析　　数据采集及显示　　光信号转换成电压脉冲后，再通过模数转换器转换成为计算机能够储存处理的数字信号。流式细胞仪的数据以FSC标准格式存储，该标准由“分析细胞学协会”制定。　　根据FSC标准，数据存储格式应包括三个文件：样本获取文件，数据设置文件和数据分析结果。4参数的单细胞分析会生成8位数据。当单个样品累计收集到10000个细胞时，FCS数据文件为80kB。　　数据采集存储完毕后，细胞亚群可以几种不同格式显示。单参数如FSC或FITC可使用直方图，横轴表示荧光通道。纵轴表示在该通道内收集到的细胞数量。处在同一通道的每一细胞均符合该通道的信号值，而且具有相同的信号密度。通道右侧信号的荧光强度明显高于左侧，越靠右侧荧光亮度越强。图5-1流式数据分析图　　双参数可在二维散点图中同时显示，X轴显示通道1，Y轴显示通道2。3维图通过X，Y，Z三个轴分别显示每个通道的细胞量。　　习题：数据采集及显示　　1在直方图中横轴和纵轴分别表示。　　2二维点图用于显示　　3在CellQuest软件中3维图中Z轴代表　　设门　　通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。如：血样本是混合细胞群，如果想单独分析淋巴球细胞，可根据FSC或细胞大小，在FSC，SSC的散点图中设门，其　　数据结果只反映淋　　巴细胞亚群的荧光特性。图5-2全血样本中淋巴细胞亚群的数据分析图　　习题：设门　　1设门的方法通常用于分析样本内的指定细胞。　　细胞亚群的数据分析　　数据分析包括从点图中的list-mode文件中显示数据,然后统计点图中的细胞分布情况。如前所述，分别有几种形式的点图用于显示数据，而且可通过设门的方法区分指定的细胞亚群。如图5-3所示，在淋巴细胞亚群周围设门，以单独分析或分选该亚群细胞。　　图5-3选定淋巴细胞亚群设门　　门内细胞的数据结果可在随后的图中显示。在下面的实例中，我们将详尽阐述细胞亚群百分含量的不同分析方法。我们可以通过单参数直方图，二维点图和三维图来分析结果。单参数直方图可定位边界，二维点图可设置象限标志。如果需要，还可以建立数据统计表以输出结果。直方图可直观单个参数的细胞数量。阴性对照用于决定直方图中单参数的左右边界。左图中M1为阴性对照峰。右图中M2为CD3FITC阳性峰。　　图5-4阴性对照峰M1和CD3FITC阳性峰M2图5-5的统计结果表明，整个事件共记录了6000个细胞，门内淋巴细胞2891个