谷氨酸棒杆菌SYPS.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，３１（１）：２９３４ ? 谷氨酸棒杆菌ＳＹＰＳ０６２Ｌ丝氨酸脱水酶活性 分析及其基因敲除对Ｌ丝氨酸积累的影响 １，２ １ １ １ １，２ 金雪霞 　张晓梅 　窦文芳 　许泓瑜 　许正宏 （１江南大学医药学院制药工程研究室　无锡　２１４１２２　２江南大学教育部工业生物技术重点实验室　无锡　２１４１２２） 摘要　以谷氨酸棒杆菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＳＹＰＳ０６２基因组ＤＮＡ为模板，扩增得到Ｌ丝氨 酸脱水酶（ＬＳｅｒＤＨ）的编码基因ｓｄａＡ。将其克隆到表达载体ｐＥＴ２８ａ（＋），并在Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中 诱导表达，对纯化的ＬＳｅｒＤＨ进行了酶活测定，并与来自Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２的重组ＬＳｅｒＤＨ进 行了比较，结果显示，两种不同菌株来源的重组ＬＳｅｒＤＨ降解Ｌ丝氨酸的酶比活力差异并不显著。在 此基础上敲除菌株ＳＹＰＳ０６２的ｓｄａＡ基因，探讨该基因对Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＳＹＰＳ０６２生长及产酸的影响。 通过构建自杀型重组质粒ｐＫ１８ｍｏｂｓａｃＢｓｄａＡ，电击转入Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＳＹＰＳ０６２中，以同源重组的方 △ 式获得了ｓｄａＡ基因缺失突变株，并用ＰＣＲ方法对突变株Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＳＹＰＳ０６２ ｓｄａＡ进行了验证。 △ 与出发菌株相比，突变菌株生长缓慢，单位菌体Ｌ丝氨酸的产量（Ｙ ）提高了１５．１３％。 Ｐ／Ｘ 关键词　Ｌ丝氨酸　谷氨酸棒杆菌　ｓｄａＡ　Ｌ丝氨酸脱水酶 中图分类号　Ｑ７８６ 　　Ｌ丝氨酸参与胞内多种氨基酸，核酸及磷脂的合 该基因沉默时Ｌ丝氨酸的利用率则大幅度下降。Ｓｕｇａ 成，广泛应用于医药、食品、农业以及化妆品等领域，市 ［６］ 等 通过不定向诱变筛选获得的丝氨酸降解能力减弱菌 ［１］ 场对其需求量日益剧增 。目前Ｌ丝氨酸的生产方法 株，而目前国内有关ｓｄａＡ基因及Ｌ丝氨酸脱水酶的研究 多为前体发酵法和酶法，即以甘氨酸、甘氨酸三甲内盐 鲜为报道。 或甘油酸为前体，通过微生物或酶法转化生成 Ｌ丝氨 　　Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＳＹＰＳ０６２是本实验室保藏的一株能 ［２３］ ［７］ 酸 。由于Ｌ丝氨酸处于氨基酸代谢的关键位置，代 够利用糖质原料产Ｌ丝氨酸的突变株 。实验克隆了 谢运转速度极快，很难在微生物体内积累，因此采用直 来自Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＳＹＰＳ０６２的丝氨酸脱水酶编码基 接发酵法生产Ｌ丝氨酸成为氨基酸研究领域的热点问 因ｓｄａＡ，成功构建了基因工程菌Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ｐＥＴ２８ａ 题，同时也是氨基酸生产领域的瓶颈之一。 ｓｄａＡ），测定了ｓｄａＡ表达的纯酶活。在此基础上通过 ［４］ 同源重组技术构建了Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＳＹＰＳ０６２ｓｄａＡ基 　　Ｎｅｔｚｅｒ等 研究表明，谷氨酸棒杆菌（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ） １３ 因缺失株，探讨该基因的沉默对 Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＳＹＰＳ