适合结构测定的完整膜蛋白.pdfVIP

客户园地 适合结构测定的完整膜蛋白-去垢剂组合的快速筛选 F. Guettou1, C. Löw1, E. Quistgard1, M. Hedrén1, J. Frauenfeld1, P. Nordlund1, L. Haneskog2, 和 P. Moberg1 1 卡罗林斯卡医学院医学生物化学与生物物理系，斯德哥尔摩，瑞典 2 GE Healthcare Bio-Sciences AB, 乌普萨拉，瑞典 完整膜蛋白（IMPs）的结构测定需要高纯度和均一性的蛋 蛋白质表达、增溶和小规模亲和纯化 白样品。在纯化过程中，从天然脂类环境中提取IMP 到去 垢剂-蛋白质复合物中。为了找到用于溶解和纯化的最佳条 通过在低温（20℃）下100 ml Terrific Broth (TB)培养基（0.2 件，需要测试不同的去垢剂。在本研究中，来自相同蛋白 mM IPTG 诱导）中表达20 小时，重组膜蛋白（具有可裂解 家族的7 个转运蛋白被重组表达在大肠杆菌中。在3-ml 的C 端六组氨酸标签）在大肠杆菌C41(DE3)中被过表达。 Superdex™ 200 5/150 GL 层析柱上进行纯化条件寻找以评 在细胞裂解后，膜组分通过超速离心（4℃，100 000 × g 估蛋白质量。这些蛋白中有5 个直接在初始稀疏矩阵筛选 离心45 分钟）被收集。膜被重悬在增溶缓冲液中（20 mM 中结晶，突出了筛选策略的强度。 磷酸钠缓冲液[pH 7.5], 300 mM NaCl, 20 mM 咪唑, 100 ×稀 释的EDTA-free Complete Protease Inhibitor Cocktail [Roche], 5%甘油）。然后小等份被快速冻存在液氮中，并 保存在-80℃。在含有冰的水浴中温和解冻后，通过4 种不 介绍 同的去垢剂溶解膜(DDM, CYMAL-5, LDAO 和 FC-12,[Affymetrix])，并在4℃下通过上下颠倒旋转孵育。不 超过60%的所有临床药物靶标实际上都是膜蛋白，因此成 可溶的物质通过超速离心被去除 （4℃，100 000 × g 离心 为制药行业主要关注的焦点。由于它们的疏水性，对这些 15 分钟）。 蛋白进行研究具有挑战性，往往能够导致表达、纯化和结 晶的显著问题。今天，关于这些蛋白的结构性信息仍然是 使用His MultiTrap FF 96 孔板根据制造商说明书通过固定 有限的。完整膜蛋白（IMPs）的纯化要求它们从细胞膜脂 化金属离子亲和层析（IMAC）进行小规模亲和蛋白纯化。 双层中进行提取，这可以通过去垢剂增溶实现。然后可以 在结合缓冲液中平衡孔（20 mM 磷酸钠缓冲液[pH 7.5] ，300 用标准的层析技术纯化所产生的水溶性去垢剂-IMP 复合 mM NaCl, 20 mM 咪唑和用于增溶的去垢剂）。未结合的蛋 物。然而，去垢剂代表一种差的脂双层模拟物，因此通常