转录报告怎样看.docx

转录报告怎样看 　　逆转录pcr　　rt-pcr为反转录rcr和实时pcr共同的缩写。逆转录pcr，或者称反转录pcr(reverse　　transcription-pcr,rt-pcr)，是聚合酶链式反应(pcr)的一种广泛应用的变形。在rt-pcr　　中，一条rna链被逆转录成为互补dna，再以此为模板通过pcr进行dna扩增。由一条rna单链转录为互补dna(cdna)称作“逆转录”，由依赖rna的dna聚合酶来完成。随后，dna的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖rna的dna聚合酶完成，　　随每个循环倍增，即通常的pcr。原先的rna模板被rna酶h降解，留下互补dna。rt-pcr的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的rna。rt-pcr广泛应用　　于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种rna的含量。　　rt-pcr有时候也会指代实时pcr(real-timepcr)。为了与逆转录pcr相区别，通常被写　　作“定量pcr”(quantitativepcr)或者rtq-pcr(real-timequantitativepcr)。实时pcr实时pcr(real-timepcr)，属于定量pcr的一种，以一定时间内dna的增幅量　　为基础进行dna的定量分析。realtimepcr的定量使用萤光色素，目前有二种方法。　　一种是在dsdna中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅dna序列中特定寡核酸序　　列相结合的一种萤光探针。realtimepcr与reversetranscriptionpcr相　　结合，能用微量的rna来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种rtpcr　　的组合又被称之为“定量rt-pcr”rt-pcr技术相关试剂　　oligo:多聚体，相当于mrna引物amv：逆转录酶dntp：脱氧核苷酸　　rnase：rna酶抑制剂　　pcrbuffer：rt-pcr缓冲液mgcl2：2价镁离子　　pcr各步骤的目的　　预变性：　　破坏dna中可能存在的较难破坏的二级结构。使dna充分变性，减少dna复杂结构对　　扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的dna模板，最好不要　　吝啬这个步骤。此外，在一些使用热启动taq酶的反应中，还可激活taq酶，从而使pcr　　反应得以顺利进行。　　变性--退火--延伸循环：①模板dna的变性：模板dna经加热至93℃左右一定时间后，使模板dna双链或经pcr　　扩增形成的双链dna解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板dna与引物的退火(复性)：模板dna经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，　　引物与模板dna单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：dna模板--引物结合物在taqdna聚合酶的作用下，以dntp为反应原料，　　靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna链互补的半保留复　　制链。　　pcr仪扩增循环后72度延伸10分钟用pcr仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因：　　1.延伸时间取决于待扩增dna片段的长度。例如，使　　用taqdna聚合酶，72度时的碱基掺入率为35-100bp/s，因此延伸速率为1kb/min。　　2.根据延伸速率推得，扩增1kb以内的dna片段1min即可，而3-4kb则需要3-4min，　　依次照推。通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min，这样做是使pcr反应完全以提高扩增产量。　　3.继续72度延伸了10分钟除了可以使pcr反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用　　是：在用普通taq酶进行pcr扩增时在产物末端加a尾的作用，可以直接用于ta克隆的进行。什么是半定量pcr　　半定量反转录－聚合酶链反应是近年来常用的一种简捷、特异的定量rna测定方　　法，通过mrna反转录成cdna，再进行pcr扩增，并测定pcr产物的数量，可以推测样品中　　特异mrna的相对数量。以半定量rt-pcr为基础建立起来的mrna含量测定技术，较含内标化　　的rt-pcr定量测定的mrna的方法更为简便可行。这种方法不另设‘内标准,排除了俩对不　　同引物之间的相互抑制和灵敏读差异，而且具有明显的剂量－效益关系和良好的重复性。步　　骤：1.抽提rna，2.反转录获得cdna，3.以cdna为模板做pcr注意：步骤1，rna抽提质量一定要好，注意污染。内参的选择，常用的有βactin和gapdh俩中。步骤　　3，半定量rt-pcr应该再两管中进行，既内参和目的基因各一管，这样便于控制，做图的时　　候可以放在一各泳道里跑！指数