绵羊kisspeptin介导的GnRH基因表达调控机制的研究-动物遗传育种与繁殖专业毕业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 Genetic Mechanisms Mediating Kisspeptin Regulation of GnRH gene Expression in Sheep A Dissertation Submitted to Shihezi University In Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Agriculture By Guo Ruo-ting (Animal Genetics Breeding and Reproduction) Dissertation Supervisor:Prof. Liu Xiaojun May,2015 石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 据我所知，除文中已经注明引用的内容外 ，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过 的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明 并表示谢意。 研究生签名： 时间： 2015 年 5 月 30 日 使用授权声明 本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论 文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校 图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索 服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 研究生签名： 时间： 2015 年 5 月 30 日 导师签名： 时间： 2015 年 5 月 30 日 摘 要 遗传学的研究表明，KISS-1 和 GnRH 是控制包括绵羊在内的动物发情的关键基因。 虽然已知绵羊 GnRH 的表达受 kisspeptin 的调控，但具体的分子机理尚不清楚。本研 究以季节性繁殖的阿勒泰绵羊为实验动物，利用双荧光素酶报告系统、RT-PCR 和实 时荧光定量 PCR 技术，并结合生物信息学分析手段，对绵羊 kisspeptin 介导的 GnRH 基因表达调控的机制进行了研究。首先，利用胚胎日龄为 55~90 天的绵羊胚胎下丘脑 组织，成功建立了原代绵羊下丘脑神经细胞培养体系，体外培养的胎羊下丘脑细胞保 留了在体内下丘脑神经元的形态和功能特征；然后，成功克隆了绵羊 GnRH 基因启动 子区-2313bp~+173bp 不同长度的片段，并构建了荧光素酶报告基因重组载体 pGL3-1、 pGL3-2、pGL3-3、pGL3-4、pGL3-5、pGL3-6、pGL3-7、pGL3-8；第三，通过双荧光 素酶报告系统检测发现，pGL3-1、pGL3-2、pGL3-3、pGL3-4、pGL3-5、pGL3-6、pGL3-7、 pGL3-8 与空载体 pGL3-Basic 相比有明显的活性（P0.05），其中 pGL3-1、pGL3-3、 pGL3-4、pGL3-5、pGL3-6、pGL3-7、pGL3-8 载体的表达活性较为相似（P0.05）， 而 pGL3-2 载体的表达活性极显著高于空载体及其他载体（P0.05），进一步的生物 信息学分析表明，绵羊 GnRH 启动子区存在有转录因子 Otx-2 的结合位点；最后，运 用 RT-PCR 和荧光实时定量 PCR 技术，对 KISS-1 及 Otx-2、GnRH、MT1 基因的组织 表达谱进行了研究，并从细胞和个体水平证明 kisspeptin 通过 Otx-2 对 GnRH 基因的表 达进行调控。综合以上试验结果，得出如下结论： 绵羊 GnRH 基因核心启动子位于-1843bp ~-1503bp 大约 300bp 的区域内，而在 -2313bp~-1843bp 的区域内可能有负转录调控元件存在；转录因子 Otx-2 可结合于 GnRH 启动子-1508bp~-1503bp 位点，kisspeptin 可能通过 Otx-2 调控 GnRH 基因的表 达。 关键词：绵羊；季节性繁殖；GnRH 基因；载体构建；双荧光素酶报告基因；启动子； 原代神经细胞培养 I Abstract Genetics study shows, KISS-1 and GnRH genes are the key genes to control the seasonal oestrus of seasonal breeding animals, including sheep. Although we have known that kisspeptin regulated expression of GnRH in sheep, the specific molecul