PCR技术教程--聚合酶链式反应（PCR）原理与相关技术.ppt

　　随温度升高，DNA双螺旋结构降解程度的曲线即熔解曲线，可用对数图和线性图表示。在扩增产物的溶解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50％的温度），用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开，因为它们在不同的温度溶解。 染料法做，探针法不做 * ppt课件 不适合染料法 * ppt课件 * ppt课件 卤素灯（白光） * ppt课件 定量 线性图与对数图正好相反，基线期在对数图中增高。 * ppt课件 * ppt课件 基线 荧光阈值 Ct值 ［DNA］0 基线：扩增线中的水平部分，由环境的噪音产生。 　　实验结束软件自动分析数据，基线取默认值3-15（循环数）。 　如果最小的Ct值18，保持默认； 　如果最小的Ct值18，基线终点改成［最小的Ct值减3］，重新分析。 　 * ppt课件 荧光阈值：在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段的任意位置上。 默认阈值＝基线（背景）荧光信号的标准偏差的10倍。 * ppt课件 Ct值的含义：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。 ［DNA］0：样本起始DNA浓度。 * ppt课件 * ppt课件 　　理论上PCR是一个指数增长的过程，但实际的PCR扩增曲线并标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR因素逐渐不满足要求，PCR效率越来越低，产物增长的速度逐渐减缓。 * ppt课件 * ppt课件 * ppt课件 绝对 * ppt课件 * ppt课件 处理与对照 * ppt课件 * ppt课件 定量PCR仪特点 ，污染机会少 * ppt课件 定量PCR的实验因素 DNA纯度：OD260/OD280=1.8, 1.6-2.0之间 DNA用量：0.05-100ng RNA纯度：OD260/OD280=2.0 cDNA用量：1-100ng总RNA反转录的cDNA取1μl 样品和标准品都需要重复，重复次数遵循统计学要求。 * ppt课件 定量PCR实验要素： 目标基因：　未知样品 生成标准：　曲线标准品梯度 监控系统：　阳性对照 监控污染：　阴性对照 校准生物学误差：管家基因 校准物理误差：参比荧光（ROX） 降低其它误差：重复实验 * ppt课件 ABI　7500 96孔板，样品量大，仪器稳定，结果分析直观。 ABI试剂ROX校正物理方面的误差： 　　　枪的误差（如试剂体积） 　　　耗材质量（如管盖厚度、透光性） 　　　仪器稳定性（如孔间、批间温度波动） * ppt课件 * ppt课件 Real-time PCR 方法的应用 绝对定量（Absolute Quantification）：拷贝数；标准是已知拷 贝数的质粒DNA。 相对定量（Relative Quantification ）：相对变化量；内标定量。 前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100%且 偏差在5%以内。 * ppt课件 * ppt课件 * ppt课件 蛋白互作 * ppt课件 * ppt课件 * ppt课件 ppt课件 * 从几个方面来解读：1、随着温度的升高，DNA双链断裂；接着温度降低，到达退火温度的时候，DNA双链复性，荧光分子绑定在DNA双链上，所以荧光信号值到达最高点。上面的是反映在扩增曲线上面的。2、接着DNA双链分子由退火温度约60度，继续升温，双链断开，DNA分子溶解。请注意溶解曲线的纵坐标，表示单位时间内荧光信号的变化量。不同的DNA有不同的Tm值，因此就有不同的特征峰。 * PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号（baseline），荧光信号之后进入指数增长阶段。软件自动给出，无需手动设置。 * * * * * * * 聚合酶链式反应（PCR）原理与相关技术 * ppt课件 一、PCR技术 二、定量PCR技术 三、数字PCR技术 * ppt课件 一、PCR原理 Polymerase Chain Reaction(PCR)：在体外特异性地扩增某个基因。 1、历史 　1971年，Khorana提出体外人工复制DNA的设想。 　1985年　Cetus公司科学家K.B.Mullis使设想变成现　　　 　　　实，采用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37℃），　 　　　并获1993年诺贝尔化学奖。 　1988年　R.K. Saiki 应用Taq DNA聚合酶（水生栖热菌） 　　　于PCR反应；同年，Cetus公司发明自动热循环仪。 K.B.Mullis * ppt课件 2、原