实时荧光定量PCR技术的原理和应用_胡忠.pptVIP

SYBR Green I法测GMO 实验结果： 定量分析 Standards/ Sample C(t) epsps C(t) Lectin 0 ND 22.6 0.1 ND 22.6 0.5 28.2 22.5 1.0 27.2 22.5 2.0 26.2 22.8 5.0 24.6 22.7 Soy Dessert 24.6 22.4 Soy Flour ND 22.2 Soy Burger 24.2 23.4 SYBR Green I法测GMO 实验结果 定量分析 Calculate ?C(t) = C(t) epsps – C(t) lectin Standards/ Sample C(t) epsps C(t) Lectin ?C(t) 0 ND 22.6 ND 0.1 ND 22.6 ND 0.5 28.2 22.5 5.6 1.0 27.2 22.5 4.7 2.0 26.2 22.8 3.4 5.0 24.6 22.7 1.9 Soy Dessert 24.6 22.4 2.1 Soy Flour ND 22.2 ND Soy Burger 24.2 23.4 0.7 SYBR Green I法测GMO 实验结果 标准曲线生成 y = -0.264x + 1.202 R 2 = 0.998 -0.40 -0.20 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 0 1 2 3 4 5 6 ? C(t) Log percent GMO 根据?C(t)值与标准品百分含量做标准曲线 SYBR Green I法测GMO实验结果 GMO定量 Standards/ Sample ?C(t) %GMO 0 ND — 0.1 ND — 0.5 5.6 — 1.0 4.7 — 2.0 3.4 — 5.0 1.9 — Soy Dessert 2.1 4.40 Soy Flour ND 0.5 Soy Burger 0.7 5 根据?C(t)值标准曲线推算未知样本的转基因成分含量 SYBR Green I法测GMO 实验结果 讨论 用于转基因成分定量生成标准曲线的样品如何设定？ 阳性材料与阴性材料按比例混合成为不同转基因百分含量的标准品 分别提取DNA 紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度，稀释至同一浓度 SYBR Green I法测GMO 讨论 PCR扩增效率 看两个反应是否具有相同的扩增效率的方法是： cDNA样品在100倍浓度梯度稀释后扩增产物△CT如何变化 斜率绝对值接近于0 为保证上述假定成立，即ExA= ExB 扩增子长度 引物设计 模板纯度、复杂度等 反应条件 谢 谢！ 谢 谢！ 放映结束 感谢各位观看！ 让我们共同进步 TaqMan法 应用范围 起始模板的定量 基因型分析 目的基因定量 产物鉴定 SNP分析 TaqMan法 优缺点 对目标序列的高特异性 ------阴性结果确定 设计相对简单 ------与目标序列某一区域互补 重复性比较好 优 点 只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针 缺 点 实时荧光定量PCR 方法 3------- Molecular beacon 法(分子信标) 标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成 环 茎 荧光素 淬灭剂 发夹型杂交探针 Molecular beacon (分子信标) 工作原理 荧光共振能量转移（FRET） 探针与DNA杂交时产生荧光 -----变性过程：产生非特异性荧光 -----延伸过程：不产生荧光 ------退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号 Molecular beacon (分子信标) 应用范围 起始模板的定量 基因型分析 产物鉴定 SNP（单核苷酸多态性）分析 Molecular beacon (分子信标) 优缺点 高特异性：对目标序列 检测SNP最灵敏的试剂之一 荧光背景低 优 点 只能用于一个特定目标 设计困难 价格比较高 缺 点 讲 座 提 纲 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应