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基因工程技术 Gene engineering technique 主要内容 概述 工具酶 载体 目的片断的制备 目的片断与载体的重组 重组子导入宿主细胞 阳性克隆的筛选及鉴定 克隆基因的表达 基因工程技术的应用 基因工程技术流程 基本概念 限制性内切酶、连接酶、AP、重组酶等 载体 转化/转染 重组/重组子/重组DNA 基因工程 重组DNA(recombinant DNA) 重组：染色体内或间进行片断交换的现象 对不同生物的DNA，在体外用工具酶，进行“剪切”、“组合”、“拼接”，使DNA按照我们的意愿重新组合。然后通过运载物质（质粒、噬菌体、病毒等统称载体）转入微生物、动、植物宿主细胞内，进行无性繁殖，使我们需要的基因在细胞中表达，产生出我们所需要的产物或组成新的生物类型 指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序 基因工程 基因工程即指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两部分。上游技术是指基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）。下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 基因工程是以分子遗传学为理论基础， 以分子生物学和微生物学的现代方法为手段， 将不同来源的基因(DNA分子)，按预先设计的蓝图， 在体外构建杂种DNA分子， 然后导入活细胞， 以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、 生产新产品。 基因工程主要内容 基本工具 基本操作程序 应用 基因工程----理论和技术背景基础 理论上的三大发现 证明了生物的遗传物质是DNA（基因工程的先导） DNA的双螺旋结构和半保留复制机理 遗传信息传递(中心法则)和密码子系统的建立 技术上的三大发现 限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志着DNA重组时代的开始） 载体的使用 1970年，逆转录酶的发现 限制性内切酶发现及应用 基因工程技术的关键 DNA ligase (glue): 1967 Restriction enzyme (scissors): 1970 Genetic engineering vector: 1973 基因工程的诞生 第一个重组DNA分子和重组的生物体 1972年，美国斯坦福大学P.Berg 把SV40 的 DNA 和λPhage DNA分别切割，又将两者连在一起，成功地构建了第一个体外重组的人工DNA分子，于1980年获诺贝尔化学奖 1973年，S. N. Cohen (科恩)等获得了抗四环素和新霉素的重组菌落TcrNer，完成了体外 DNA 重组和扩增的全过程，标志着基因工程的诞生 1973年为基因工程元年 基因工程的发展 基因工程的艰难阶段 关于基因工程的争议： 起因：产物是生物，即具有巨大的理论和实践意义，又具有非常大的危害性。 焦点：基因工程产生的杂种生物和基因的扩散问题， 列如：产生的有害微生物和病毒如果逸出的问题、产生的高等植物的花粉传播问题等等 从1972年到1976年，人们对DNA重组所涉及的载体和受体系统进行了有效的安全性改造，包括噬菌体DNA载体的有条件包装以及受体细胞遗传重组和感染寄生缺陷突变株的筛选，建立了一套严格的DNA重组试验室设计与规范操作 基因工程的发展 基因工程的逐渐成熟阶段 1977年，日本科学家首次在大肠杆菌中克隆并表达了人生长激素释放抑制素基因，首次实现真核基因的原核表达 随后，美国的Ullvich克隆并在大肠杆菌中表达了人胰岛素基因 1978年，美国Genentech公司开发出利用重组大肠杆菌合成人胰岛素，1982获准使用。 基因工程的发展 1982 世界上第一只转基因动物 --- “巨鼠” 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊）， 中国水生所转基因鱼 1990 HGP实施 1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 英国罗斯林研究所 多莉羊 2000 人类基因组草图绘制完成 基因工程的操作流程 分：目的基因和载体的获得 切：目的基因和载体的限制性酶切 连：目的基因和载体的连接(体外重组) 转：连接产物(重组体)导入宿主细胞 筛：重组体的扩增、筛选 目的基因在细胞的表达、分离、纯化、鉴定等 一、目的基因的获得 目的基因的获得 PCR方法获取： 化学合成法 ： 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 局限性：短片段、简并性、高费用 目的基因的获得 基因组DNA文库(genomic DNA library) 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。 目的基因的获得 cDNA文库： 以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接