颗粒溶素与穿孔素的表达及其对肺癌细胞影响的研究-临床检验诊断学专业论文.docxVIP

兰州大学研究生学位论文电子版使用授权书《颗粒溶素和穿孔素的表达及其对肺癌细胞影响的研究》是本人在兰州大学 兰州大学研究生学位论文电子版使用授权书 《颗粒溶素和穿孔素的表达及其对肺癌细胞影响的研究》是本人在兰州大学 攻读博士口／硕上M学位的毕业论文，现己通过答辩。本人作为此论文的著作权人， 同意向兰州大学图书馆提交该论文的电子版和印刷本各一份。 根据《中华人民共和国著作权法》的规定，本人授权兰州大学图书馆对该论 ▲ ▲ 文电子版享有以下权力：(同意者画√) 弋 1、同意提交全文。可以在提交 半年(公丌)口 一年(秘密)kf 二年(机密) 口 三年(绝密)口 期限之后，由图书馆在校园网上提供全文浏览。 2、本人论文解密之后，同意向“CALIS高校学位论文全文数据库”提交： 论文标题、提要和论文前16页卜1 论文全文 口 3、不同意提交电子版论文口。 (选此项者，须由作者本人出具不能公开 证明，导师签字，院系所加盖公章。) 图书馆承诺： 1、不对论文从事收集、保存、发布以外的其他活动； 2、未经著作权人同意，不得从事营利性活动。 院系：笛一l瞧床医学院作者(授权人)签名：王晚霞皇鲢 时问：2009．5．26 被授权人：兰州大学图书馆 关于学位论文向“CALIS高校学位论文全文数据库”授权的说明 随着网络和计算机技术的发展，近儿年来在国际范围内进行着一种人学范同内的学术资 源共建、共享运动，日的是促进学术团体内学术资源的交流和使JL}j。 “CALIS高校学位论文全文数据库”是教育部支持的高等教育文献保障体系(CALIS) 的一个学位论文共建共享项目。目的是为中国高校范闱内的读者通过网络利刚博硕十学何论 文信息提供途径和保障。参加CAL LS学何论文库建设的成员单位(约白．所人学)之问可免费 检索浏览获得授权的论文全文。在获得作者授权方面，“CAL LS高校学位论文全文数据库”采 H】作者自愿的原则，作者是否授权完令由臼己决定。 作者授权给“CAL LS学位论文全文数据库”后享有的权豁有：1)提高学位论文的-f吏Jtj率， 台：更J“的范罔内被柃索浏览，提高论文的影u向力；2)授权往“CALLS学何论文全文数据庠” 发布论文全文的作者，可K期免费检索浏览该库收录的论文全文：3)对检索浏览率高的论文 推荐出版}}“：式出版。 访问地址：http：／／etd．caliS．edu．cn 兰州人学硕I：学位论义目 兰州人学硕I：学位论义 目 录 摘 要 ．．I Abstract ．．．． ．．．．． ． ．． ． ．．． ．．．．．． ．．． ．．III 第一部分前言 ．1 ▲ 1．1研究背景 ．1 ■ 1．2国内外研究现状 4 厦 1．3研究目的及意义 6 第二部分颗粒溶素和穿孔素基因的克隆 7 2．1材料 7 2．2方法 8 2．2．1 人外周血单个核细胞的分离及体外培养 ．8 2．2．2 颗粒溶素和穿孔素基因片段的获取 9 2．2．3 pMD．GNLY和pMD—PFP的构建 12 2．3结果 15 2．3．1 外周血单个核细胞的体外培养 ．15 2．3．2 RT-PCR获取目的基因 16 2．3．3 pMD—GNLY和pMD．PFP的鉴定 16 2．4讨论 21 第三部分颗粒溶素的原核表达 22 3．1材料 22 3．2方法 24 3．2．1 PCR获取日的基因 ．24 3．2．2 pMD—GNLY9K和pMD—GNLYl5K的构建 24 ▲ 3．2．3 pET-GNLY9K和pET-GNLYl5K的构建 25 3．2．4 pET-GNLY9K和pET-GNLYl5K转化至Rosetta fDE3)菌 25 3．2．5 融合蛋fLl的诱导表达及表达条件优化 26 3．2．6 Western．blotting检测 27 3．3结果 28 兰州人学侦lj学位论文3。3．1 兰州人学侦lj学位论文 3。3．1 PCR获取目的基因 ．．28 3．3．2 pMD-GNLY9K和pMD—GNLYl5K的鉴定 28 3．3．3 pET-GNLY9K和pET-GNLYl5K的鉴定 29 3．3．4 融合蛋白的诱导表达及表达条件的优化 ．29 3．3．5 Weste rn—blotting检测 ．．32 人 ▲ 3．4讨{仑 32 ^ 第四部分颗粒溶素和穿孔素真核共表达及其对A549细胞的影响 ．．35 4．1材料 35 4．2方法 37 4．2．1 PCR获取目的基因 ．37 4．2．2 pMD·GNLY9和pMD—PFP2a的构建 38 4．2．3 真核表达质粒的构建 38 4．2．4 重组质粒的纯化 40 4．2．5 重组质粒的细胞转染及表达 40 4．2．6 统{十 43 4．3结果 ．43 4．3．1 PCR获取目的基因 ．43