WB注意事项及常见问题.doc

WB注意事项及常见问题 注意事项 样本收集 组织样本 原则上要求客户或我们的技术员把组织分切剪碎至研磨管（根据实验的需要告知他们取多少组织），并加入适量裂解液和研磨珠，然后放置于-80℃保存。具体详情参照“组织样本收集注意事项.doc”； 细胞样品 原则上要求客户或我们的技术员不要用胰酶把细胞消化下来，特别是分选对象是膜蛋白时，具体详情参照“细胞样品收集注意事项.doc”； 总蛋白提取 组织样品 具体详情参照“组织样本收集注意事项.doc”；记得加入蛋白酶抑制剂，如果分选对象是磷酸化蛋白时，记得加入磷酸化酶抑制剂； 细胞样品 具体详情参照“细胞样品收集注意事项.doc”；记得加入蛋白酶抑制剂，如果分选对象是磷酸化蛋白时，记得加入磷酸化酶抑制剂； 蛋白样本保存 裂解细胞或组织提取总蛋白时，细胞碎片沉淀一般-20℃保存以防万一，提取好的蛋白样品分装2份，一份加入上样缓冲液变性后-20℃保存，一份直接-20℃保存； 蛋白变性 提取好的总蛋白取一部分（不是全部）加入上样缓冲液进行加热变性（100℃，5min），变性好的蛋白应该-20℃保存，冻融后不再需要加热变性； SDS 浓缩胶的胶浓度一般为5%，用于压沉样品； 分离胶的胶浓度取决于分析对象的分子量大小，详情见Western Blotting 全攻略.pdf第4页； 分离胶和浓缩胶的高度比为8:3； 电泳结束后，应及时用清洗干净玻璃板，清洗时应使用海绵擦布，切勿使用刷子，以免刮花玻璃板； 电泳结束后，应及时冲洗电泳槽，以免盐离子沉积，导致电泳丝腐蚀； 清洗电泳芯时，一定要注意别弄段电泳丝； 转膜 注意海绵垫，滤纸（转膜专用滤纸），转印膜，胶的叠放位置，以保证正确的转印方向； 注意海绵垫，滤纸（转膜专用滤纸），转印膜，胶的相对大小，以免造成短路； 转印结束后，应及时取出转印膜，并立即用TBST漂洗1-2遍，并立即加入封闭液，这样可以避免膜上的杂质残留或膜变干导致背景高的问题； 转印结束后，应及时冲洗转印槽和转印芯，以免盐离子沉积，导致电泳丝腐蚀； 转印结束后，应及时用水泡洗海绵垫和滤纸，以免盐离子沉积，导致转膜时短路，并放在篮子上晾干，如果海绵垫和滤纸不及时晾干，容易导致海绵垫和滤纸内部的结构破坏； 封闭 1. 进行封闭时，应加入足量的封闭液（以完全覆盖膜为底限），并保证整个封闭过程中，膜与封闭液充分接触，避免长时间离开封闭液，特别进行4℃静止封闭过夜时，一定要加入足量的封闭液和保证平坦放置；上述注意事项主要为了避免膜变干，导致背景升高； 一抗杂交 一抗的稀释比例：第一次使用时参考具体抗体说明书建议的稀释比例，并根据实际的实验结果进行调整； 杂交条件：如果是室温孵育，至少保证孵育1-2小时，并放置脱色摇床上进行摇晃，如果是4℃孵育，应孵育过夜，可静止亦可放置脱色摇床上进行摇晃； 应使用专用的一抗稀释液进行稀释，使用后进行回收并4℃保存，如果回收的稀释抗体用沉淀或长菌，应丢弃； 一抗杂交后洗膜 一般使用标准的TBST缓冲液，如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高，可以把NaCl的浓度提高到500 nM (标准的为150nM); 一般洗涤3次，每次10min，如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高，可以把洗涤次数提高到4-6次； 二抗杂交 1. 二抗的稀释比例：第一次使用时参考具体抗体说明书建议的稀释比例，并根据实际的实验结果进行调整； 2. 杂交条件：一般室温孵育，孵育1小时即可（时间延长会产生非特异杂交，从而导致背景过高），并放置脱色摇床上进行摇晃（一定要避免膜变干，否则背景其高）； 3. 应使用封闭液进行稀释，使用后进行不回收； 二抗杂交后洗膜 1. 一般使用标准的TBST缓冲液，如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高，可以把NaCl的浓度提高到500 nM (标准的为150nM); 2. 一般洗涤3次，每次10min，如果判断因为是一抗的原因导致的背景过高，可以把洗涤次数提高到4-6次； 拍照 1. 注意选择曝光时间，同时兼顾工作效率，因选择连续拍照模式，这样总有一个何时曝光时间； 报告单整理 原始图片； 对比度和亮度调整的图片； 图片说明：上样顺序； 灰度值：原始值，数据标准化（同一个样品的目标蛋白的灰度值除以内参蛋白的灰度值），相对表达量（实验样品的数据标准化比值除以参照样品（问客户）的数据标准化比值），参照样品的相对表达量一定为1； 实验方法：准确的一抗，二抗，稀释比例； 常见问题 没信号 膜一片空白，没有任何条带，阳性对照样品也无条带：实验失败？抗体失效？；重新进行实验，重新稀释抗体； 膜一片空白，没有任何条带，阳性对照样品有条带：实验样品降解？实验样品无该蛋白的表达？转膜效率过低？；重新进行实验，复核查找上述原因，以寻找对策； 背景过高 目的条带以外的区域有信号，如果是片