荧光共振能量转移.docVIP

word格式文档 专业整理 FRET技术研究PEDF和目标蛋白 之间在小鼠神经元（神经胶质细胞）的 相互作用 一、FRET技术基本原理 荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。FRET是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。能量转移的效率和供体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、供体与受体的跃迁偶极的相对取向、供体与受体之间的距离等因素有关。作为共振能量转移供、受体对，荧光物质必须满足以下条件： ①受、供体的激发光要足够分得开； ②供体的发光光谱与受体的激发光谱要重叠。 人们已经利用生物体自身的荧光或者将有机荧光染料标记到所研究的对象上，成功地应用于核酸检测、蛋白质结构、功能分析、免疫分析及细胞器结构功能检测等诸多方面。（传统有机荧光染料吸收光谱窄，发射光谱常常伴有拖尾，这样会影响供体发射光谱与受体吸收光谱的重叠程度，而且供、受体发射光谱产生相互干扰。最新的一些报道将发光量子点用于共振能量转移研究，克服了有机荧光染料的不足之处。相对于传统有机荧光染料分子，量子点的发射光谱很窄而且不拖尾，减少了供体与受体发射光谱的重叠，避免了相互间的干扰；由于量子点具有较宽的光谱激发范围，当它作为能量供体时，可以更自由地选择激发波长，可以最大限度地避免对能量受体的直接激发；通过改变量子点的组成或尺寸，可以使其发射可见光区任一波长的光，也就是说它可以为吸收光谱在可见区的任一生色团作能量供体，并且保证了供体发射波长与受体吸收波长的良好重叠，增加了共振能量转移效率。）? 以GFP的两个突变体CFP（cyan fluorescent protein）、YFP（yellow fluorescent protein）为例简要说明其原理：CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱有相当的重叠，当它们足够接近时，用CFP的吸收波长激发，CFP的发色基团将会把能量高效率地共振转移至YFP的发色基团上，所以CFP的发射荧光将减弱或消失，主要发射将是YFP的荧光。两个发色基团之间的能量转换效率与它们之间的空间距离的6次方成反比，对空间位置的改变非常灵敏。例如要研究两种蛋白质a和b间的相互作用，可以根据FRET原理构建融合蛋白，这种融合蛋白由三部分组成：CFP（cyan fluorescent protein）、蛋白质b、YFP（yellow fluorescent protein）。用CFP吸收波长433nm作为激发波长，实验灵巧设计，使当蛋白质a与b没有发生相互作用时，CFP与YFP相距很远不能发生荧光共振能量转移，因而检测到的是CFP的发射波长为476nm的荧光；但当蛋白质a与b发生相互作用时，由于蛋白质b受蛋白质a作用而发生构象变化，使CFP与YFP充分靠近发生荧光共振能量转移，此时检测到的就是YFP的发射波长为527nm的荧光。将编码这种融合蛋白的基因通过转基因技术使其在细胞内表达，这样就可以在活细胞生理条件下研究蛋白质-蛋白质间的相互作用。 黄色荧光蛋白报告载体，如下图： 青色荧光蛋白报告载体，如下图： 一．质粒的选择及载体构建： 订购： 1.带有Sal I和Sac II两个酶切位点的小鼠PEDF过表达克隆质粒 2.带有Kpn I和Xba I两个酶切位点的小鼠目标蛋白过表达克隆质粒 3.pECFP．C1质粒 4.pEYFP．C1质粒 5. Sal I、Sac II、Kpn I、Xba I内切酶 6.dna合成酶等 二． PEDF核青色荧光蛋白（pECFP-C1）表达载体的构建及鉴定 小鼠c57PEDF序列blst获得： 1 atgcaggccc tggtgctact cctctggact ggagccctgc tcgggcacgg cagcagccag 61 aacgtcccca gcagctctga gggctcccca gtcccggaca gcacgggcga gcccgtggag 121 gaggaggacc ccttcttcaa ggtccctgtg aacaagctgg cagcagctgt ctccaacttc 181 ggctacgatc tgtaccgcct gagatccagt gccagcccaa cgggcaacgt cctgctgtct 241 ccactcagcg tggccacggc cctctctgcc ctttctc