免疫荧光组织化学技术-免疫荧光技术原理及步骤.pptx

免疫荧光技术原理及步骤; 基 本 原 理 荧光显微镜 操 作 步 骤;Albert H. Coons(1912 –1978);免疫荧光 (Immunofluorescence, IF)技术，是根据抗原－抗体反应的原理，用已标记了荧光素的荧光抗体（抗原）作为探针检查组织或细胞内相应的抗原（抗体），在组织或细胞中所形成的抗原－抗体复合物上沉着有荧光素，在荧光显微镜下观察样品，荧光素受激发光的照射而发出荧光，通过荧光所在的细胞或组织， 实现对抗原或抗体的定位，同时还可利用定量技术对样本进行定量。 ; 该技术将抗原??体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合； 以荧光素作为标记物，与已知抗原或抗体结合，但不影响其免疫学特性； 借助荧光显微镜，直接观察呈现特异性荧光的抗原-抗体复合物及其分布。;紫外光激发荧光物质放射荧光示意图;技术特点 特异性强 敏感性高 速度快 适应性广 主要缺点是：非特异染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也比较复杂。;根据实验方法分类 （1）直接法 （2）间接法 （3）补体法 （4）其他法;直接法;直 接 法 ;间接法;间 接 法 ;补体法;补 体 法 ;其他免疫荧光技术;时间分辨荧光免疫测定;TRFIA的特点;荧光偏振免疫分析技术; 基 本 原 理 荧 光 显 微 镜 操 作 步 骤;显微镜的尺度;显微镜的功能;显微镜的观察方式;荧光显微镜;荧光显微镜的主要部件;反光镜：一般使用平面反光镜 聚光镜：用石英玻璃或其他透过紫外光的玻璃制成 物镜：最好使用消色差的物镜，因其自体荧光极微且透光性能（波长范围）适合荧光 目镜：多使用低倍目镜 落射光装置：既具透射式光源的功能外，更适用于不透明及半透明标本，如厚片、滤膜、菌落、组织培养标本等的直接观察。;明场：透射 荧光：落射 落射的优点：? 物镜的聚光镜作用使视场均匀，发射光强度高。? 激发光损失小，荧光效应高。;激光共聚焦扫描显微镜;共聚焦的本质？ ------荧光显微镜 共聚焦不是万能的，它还是光学显微镜，无法突破光学显微镜的极限 共聚焦是荧光观察方式，有着荧光显微镜一切优缺点 优点：放大好；对比强；对细胞刺激小；能进行多重标记 缺点：Z轴分辨率不高；荧光容易衰减和淬灭;荧光显微镜标志制作要求;荧光显微镜使用注意事项; 基 本 原 理 荧 光 显 微 镜 操 作 步 骤;（一）制 片;（二）固 定;常用抗原物质固定方法;（三）水 洗;（四）染 色;（四）染 色;;（五）结果显示;（六）标本保存;The End ！