实验PCR产物T载体克隆与转化.pptVIP

材料：目的基因片段（回收的PCR产物） 药品：pEMG T-Vector (Promega公司) 实验原理 普通Taq酶会在3′末端加一个A，这样所有PCR产物都会在双链DNA的3′端均有一个单链状态的A； T-载体是线状DNA片段，在DNA双链的3′端均有一个单链状态的T； 二者在连接酶的作用下连接为一个重组的环状分子，从而达到克隆的目的。 pGEM-T Easy 载体的结构 实验步骤 （1）目的片段的制备--胶回收法回收PCR产物： (2)连接实验： 在0.2ml PCR管加入以下试剂： 目的片段（100ng/ul） 3μl pGEM-T Easy（50ng/ul） 1μl T4 DNA Ligase 1μl 2×Rapid Ligation Buffer 5μl Total 10 μL 备注：混合均匀，瞬时离心。 4℃连接16小时，-20储存或直接用于转化。 说 明 1.回收DNA片段可以用沉淀法，但是只适用于PCR扩增产物为单一片段，而且需要检测PCR扩增结果后进行； 2.此种连接方法是根据普通Taq酶会在3′末端加一个A的原理发明的；注意不同的酶的性能不同，保真性强的Taq酶会自动切除末端的A，所以，这种酶的扩增产物需要补加A后再连接。 3.T-载体的阳性克隆筛选同样可以使用“蓝白斑”法，方便，快捷。 α互补筛选（蓝-白筛选） PCR产物的T载体克隆和转化 实验目的： 学习T载体的特点和PCR产物的克隆方法。 实验要求： 掌握利用T载体克隆PCR产物的方法；复习连接实验流程。 技术应用： 目的基因片段与T载体DNA连接，达到克隆基因的目的。 　 质粒（plasmid） 是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA 分子。大小约为 数千碱基对。常 有1 ~ 3个抗药 性基因，以利于 筛选。 质粒载体 克隆的质粒载体 允许外源的DNA插入，储存。主要是DNA水平上的操作。 基因表达的质粒载体 允许外源DNA的插入、储存和表达。 载体结构的三大要素： 多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ） 独立的复制单位 pGEM-T 载体的结构 * * * * * 志比昆仑 学竞江河 青海大学 Qinghai University 青海大学 Qinghai University 志比昆仑 学竞江河 青海大学 Qinghai University 医用分子生物学 实验技术 青海大学医学硕士研究生课程 重组DNA技术操作步骤 基本原理 目的基因的获取 DNA导入受体细胞 外源基因与载体的连接 克隆载体的选择和构建 重组体的筛选 克隆基因的表达 主要步骤： ① 制备目的基因和选择相关载体 ② 目的基因和有关载体进行连接 ③ 重组的DNA导入受体细胞 ④ DNA重组体的筛选和鉴定 ⑤ DNA重组体的扩增、表达和其他研究 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 （三）PCR扩增特定基因 （四）人工合成 一、目的基因的获得——分 （一）从基因组文库中获得 （二）从cDNA文库中获得 组织或细胞染色体DNA 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合 从基因组DNA文库获取目的基因 限制酶切位点 限制酶消化 除去中间片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色体DNA 限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌 ~20 Kb DNA 片段 cos L R cos ~20 Kb 外源 DNA 片段 基因文库 用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 从cDNA文库获取目的基因 逆转录酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ 碱水解 T T T T 化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。 几种常用克隆载体的比较 注：+表示可用；-表示不可用 比较内容