洋葱鳞片叶表皮细胞的细胞骨架观察实验报告课件.doc

洋葱鳞片叶表皮细胞的细胞骨架观察实验报告 吴若自然科学大类 16307110316 单周四 119 2016/11/17 一、实验目的 : 1. 掌握用光学显微镜观察植物细胞骨架的原理及方法。 2. 认识细胞骨架的形态，联系细胞骨架的功能。 二、实验原理： 细胞骨架是指真核细胞中的蛋白纤维网架体系。 广义的细胞骨架包括细胞核骨架、 细胞 质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。 根据蛋白质纤维的直径、组成成分和组装结构的不同可分 为微丝、 微管和中间纤维。 细胞骨架对于维持细胞的形态结构及细胞运动、 物质运输、 能量转换、 信号传导和细胞分裂等有重要的作用。 本试验采用去垢剂 TritonX-100 的缓冲液处理植物材料时， 可将细胞的膜结构和大部分蛋白质抽提掉， 但细胞骨架系统的蛋白却被保存下来， 后者用考马斯 亮蓝 R250 染色，在光学显微镜下可见一种网状结构。 三、操作步骤： 1. 取洋葱内皮表层膜 1cm2(可多取两片 )左右置于含 2mlPBS 液的小皿中湿润 5min 后，吸 去 PBS 2. 向小皿中加入 1.5mlTritonX-100(1%) ，浸没 20min 后，吸走 TritonX-100 3. 向小皿中加入 2mlMbuffer 浸没置于摇床上 5min，重复两次后，吸走 Mbuffer 4. 向小皿中加入 105ml 戊二醛（ 3%），浸没 30min 后，吸走戊二醛 5. 向小皿中加入 2mlPBS，浸没置于摇床上 5min，重复两次 6. 取出表皮平铺于载玻片上，滴加 100 微升，静置 100min 后吸取染料 7. 向表面滴加蒸馏水洗涤后用纸巾洗去液体，重复两次 8. 盖上盖玻片，擦去残余液体，用光学显微镜观察并拍照记录 四、实验结果： 如图所示， 洋葱内表皮细胞轮廓清晰可见， 细胞壁及其分界明显可见。 可观察到线 性纤维交织而成的网状结构， 同一细胞内各处骨架密集度不均匀， 细胞核区域纤维较密 集，蓝色较重。 调节显微镜焦距可观察到细胞不同横切面的网络结构的变化， 表明细胞 骨架以三维立体结构的形式分布在整个细胞内。 五、思考题： 1. 简述细胞质骨架的基本类型及结构特征 答：微管： 中空的圆筒状结构， 直径为 18nm ～25nm ，构成微管的主要成分是微管 蛋白。这种蛋白有两个亚基，即 α， β亚基它们成螺旋形排列。进化高度保守。 微丝：由肌动蛋白组成的直径约为 7nm 的骨架纤维，单体形式的球形肌动蛋白聚 合形成纤维形肌动蛋白，在微丝结合蛋白的辅助作用下形成微丝高级结构，行使功 能。 中间纤维： 中空的骨状结构， 直径介于微管微丝之间， 具有明显的组织细胞特异性， 基本结构为一个中央 α螺旋杆状区辅以两侧大小和化学组成不同的端区。 2. 本实验观察到的蓝色纤维主要是哪种细胞骨架？ 答：应为微丝和中间纤维。 3. 考马斯亮蓝染色方法的优缺点。 答：优点：反应相对迅速，其结合物在室温下 1h 内保持稳定，试剂配置简单，操 作简便。 缺点： 用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，仍有一些物质干扰此法的测定。 六、实验讨论： 1. 观察和分析细胞骨架的意义？ 答：细胞骨架是细胞结构的重要组成部分，也是细胞行为与功能的重要调节系统， 观察和分析细胞骨架的性质与变化将帮助我们更好地认识和研究细胞性质、 功能与 机制。 2. 考马斯亮蓝是一个理想的细胞骨架染料吗？本实验的优点和缺点是什么？ 答：不是，特异性荧光染料可能更好。本实验优点是反应相对迅速，其结合物在室 温下 1h 内保持稳定，试剂配置简单，操作简便。缺点是无法直观分辨微管，微丝 和中间纤维等。