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低渗透油藏微生物驱油试验研究 指导教师：褚庆忠 课题组长：刘志文 课题组员：杨震、毛雨涵、蒋志宇 项目研究步骤 该项目主要分为两个阶段： 一、培养细菌，并筛选出能够耐高温高压的产多糖的细菌，并对菌种进行保藏。对所得细菌进行探索性研究。 二、利用所筛选出来的菌种，进行生物驱油实验。 第一阶段细菌的制备与探索性研究 一、研究的基本内容，拟解决的主要问题 1.研究的基本问题 本研究主要从海水中培养以及筛选产多糖的细菌，通过分离纯化，以及菌种的初筛、复筛、菌种的鉴定，筛选出能够耐高温高压的产多糖的细菌，并对菌种进行保藏。并对筛选的高温高压的产多糖的细菌进行探索研究。 2.拟解决的主要问题 通过从海水中筛选富集细菌，来筛选出能够耐高温高压的产多糖的细菌，并通过鉴定辨别菌种，并进一步探索出筛选出的耐高温高压的产多糖的细菌的应用价值。 微生物获取过程 微生物的筛选 测定含糖量，筛选最适微生物。 测试所选微生物性质并记录。 第一阶段工作成果 产多糖菌的初筛 分别从秦皇岛浅水湾和燕大食堂下水道污泥中取样，将样品经过梯度稀释后分别涂布于LB固体培养基上，培养2天后观察发现两种菌源的平板上都长满了菌落，如下图： 产多糖菌的复筛 对初筛分离的纯种菌接种到液体发酵培养基中，分别对应编号1-7号，经过摇床震荡培养4天，取出1-7号的锥形瓶，观察发酵液的粘稠情况和多糖颜色以及沉淀情况。具体结果如右表： 仔细观察菌落团中的不同菌落，选定外观比较粘稠的菌落，经过镜检确定各个菌落的形态特征，用接种针挑出形态不一致的细菌，挑选的菌落多为无色菌落且在挑取的情况下能形成连续的拉丝，在LB培养基平板上划线培养，重复两次，得到纯种。编号分别为1、2、3、4、5、6、7 如下图： 标准曲线： 苯酚-浓硫酸标准曲线的制备 取1.9g烘干的分析纯葡萄糖溶于1L蒸馏水，制成1.9mg/mL的标准溶液。然后取标准溶液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL分别稀释到100mL，制成浓度为19μg、38μg、57μg、76μg、95μg、114μg、133μg、152μg/mL的溶液，取各溶液0.6mL置于干燥的洁净试管中，加入50 mg/mL的苯酚溶液1.2 mL，混合均匀，迅速加入6.0 mL浓硫酸，混合均匀，室温静置30 min，于波长490 nm测定吸光度，蒸馏水作为空白管对照。以糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标得标准曲线，根据该曲线可以测定寡糖或多糖中的糖含量。 待测样品多糖的测定与计算 分别取1-7号锥形瓶发酵液1mL，稀释100倍，取稀释液0.6mL，加入50mg/mL的苯酚溶液1.2mL，混合均匀，迅速加入6.0mL浓硫酸，混合均匀，室温静置30min，于波长490nm测定吸光度，蒸馏水作为空白管。读出吸光度数值之后于标准曲线上即可查出对应的糖浓度。 经过读数可得1-7号稀释样品的平均吸光度值依次为0.213、0.408、0.958、0.423、0.882、0.647、0.502。在标准曲线上查询可知1-7号稀释样品的葡萄糖浓度分别为31.93、42.38、148.72、45.64、125.75、82.23、52.64μg/mL。因此1-7号发酵液中的多糖浓度依次为3.29、4.24、14.87、4.56、12.58、8.22、5.26 mg/mL。以下是所用分光光度计型号： 由观察可知3号和5号颜色最深且发酵液粘稠，再由以上测定数据可知3号发酵液中多糖含量最大，由此可以知道3号菌株产多糖量最大，最符合实验目的。 菌种初步鉴定 菌种菌落形态观察 对经过LB平板筛选到的3号纯种菌株进行形态观察得到如下结果： 菌种生理生化特征分析 革兰氏染色实验 菌株3号经过革兰氏染色后显微镜下观察，菌体为杆状，呈紫色，故为革兰氏阳性菌。如下图： 淀粉水解实验 将菌株3接种到淀粉水解培养基上，37℃下培养24 h后，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘液，菌苔周围出现无色透明圈，所以菌株3的淀粉水解试验呈阳性，能产生胞外淀粉酶。 石蕊牛奶实验 将菌株3接种到石蕊牛奶培养基中，35℃下培养36h，试管底部变白，所以菌株3能还原石蕊。 甲基红实验 将菌株3接入到甲基红培养基中，37℃下培养48h，加入甲基红指示剂2滴，培养基变黄，故菌株3的甲基红试验呈阴性，葡萄糖作碳源不能产生有机酸，甲酸、乙酸、乳酸等等。 吲哚实验 将菌株3接入到蛋白胨水培养基中，37℃下培养48 h，加入指示剂后，在乙醚和培养基之间没有产生红色