HBV定量检测(见习).ppt

Figure 3. Mutation detection by melting curve analysis. Top panel: melting curves of amplified gene fragments from wild-type and mutant individuals. Bottom panel: negative first derivatives of the melting curves showing the unique melting peak of each genotype. The gene fragment amplified from the heterozygous individual exhibits a melting curve with both the wild-type and mutant peaks (red plot). HBV的定量检测 标本：病人血清200μl 检测：HBV病毒核酸载量 检测样本：阳性对照、阴性对照、空白对照 标准品、病人HBV DNA 检测步骤：HBV DNA提取； 荧光定量 PCR； 结果分析 定量PCR方法：TaqMan水解探针技术 标准品扩增曲线 标准曲线 报告结果： HBV DNA拷贝数/ml， 如 6.20×106拷贝数/ml或6.20 E +06? 参考范围：最小检测值，5×102拷贝数/ml（5E+02） * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * HBV定量检测 (HBV Quantitive Detection) 乙型肝炎病毒（hepatitis B virus HBV） 环状双链结构 长链：L(－), 长度固定，携带全部编码信息 短链：S(＋), 在不同分子中长短不一 两条链的5’端序列(250-300bp)互补，使保持环状结构，也是最常整合到肝细胞染色体的DNA序列 DR区是DNA成环和病毒复制的关键区域 HBV基因有4个ORF，分别为S、C、P、X区： S区编码外膜蛋白,分为S基因、前S1基因和前S2基因；前S区与病毒的嗜肝性有关 C区编码HBcAg；前C和C区编码HBeAg HBeAg为HBV复制和具有强感染性的指标 变异率较大区域 P区：是最长的一段，与其他部位有重叠，编码产物为依赖于RNA的DNA聚合酶 X区：编码蛋白为HbxAg，是一种反式作用因子，与病毒基因表达有关 HBV DNA的复制周期（I） HBV颗粒吸附并进入肝细胞 脱去衣壳，病毒DNA进入肝细胞核内 病毒正链以负链为模板，形成开口环状双链DNA （需DNA聚合酶） 以负链DNA为模板转录 (需RNA聚合酶) 2.1kb RNA: 翻译外衣壳蛋白 3.5kb RNA: 翻译内衣壳蛋白，还作为病毒DNA复制的模板（前基因组） 构成完整成熟的病毒颗粒，从细胞浆中释出细胞外 PCR基因的原理 一、PCR技术的发展及原理 1971年，Kleppe等人首次在文章中准确、客观地阐述了PCR方法。 1985年，美国PE-Cetus公司的Kary Mullis等人发明PCR技术。 PCR技术的本质是体外核酸扩增，加热使双链DNA解开螺旋，在退火温度条件下引物同模板DNA杂交，在Taq DNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物，重复 “变性→退火→引物延伸”过程至25-40个循环，呈指数级扩大待测样本中的核酸拷贝数。 PCR的基本原理 PCR基因扩增仪的工作原理 PCR基因扩增仪工作关键是温度控制 技术在PCR反应体系中加入特异性的荧光染料或探针，荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的增加，通过检测荧光信号，从而实时监测整个PCR反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。 荧光实时定量PCR（real-time quantitative PCR,RQ-PCR） 荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR） 又称实时PCR，目前较精确的进行定量检测PCR的方法 FQ-PCR通过荧光信号对PCR过程中产物量进行实时监测，精确计算出PCR的初始模板量 荧光定量PCR是融合了PCR高灵敏性、DNA杂交高特异性和光谱分析的精确性，直接检测扩增过程中双链DNA荧光信号的变化以获得定量的结果。 系统内装置有半导体PCR、卤钨灯光源激发荧光信号、光栅分光、超低温光电耦合器（CCD）摄象机收集荧光信号、计算机软件分析系统等。 荧光定量PCR检测的是样本的初始浓度，而准确测定初始浓度需要在对数期进