GB/T 22915-2008口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测方法.pdf

ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 22915—2008 口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测方法 Protocol of universal fluorogenic RT-PCR for foot and mouth disease virus 2008-12-31 发布 2009-05-01 实施 发布 GB/T 22915 2008 -1.Z- —1— 刖 弓 本标准参考了世界动物卫生组织 （（）IE） 《陆生动物诊断试验和疫苗手册（哺乳动物、禽鸟与蜜蜂）》 （第5版）。 本标准的附录A 、附录C为规范性附录，附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出入境检验检疫 局、中国检验检疫科学研究院° 本标准主要起草人:花群义、杨云庆、秦智锋、周晓黎、卢体康、董俊、陶虹、阮周曦、叶弈优、林祥梅、 吴绍强。 T GB/T 22915—2008 口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测方法 1范围 本标准规定了口蹄疫病毒荧光RT-PCR检测的操作方法。 本标准适用于动物及其动物产品中口蹄疫病毒的检测。 2缩略语 下列缩略语适用于本标准。 2. 1 荧光 RT-PCR 荧光反转录-聚合酶链反应。 2. 2 Ct 值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值吋所经历的循环数。 2.3 RNA 核糖核酸。 2.4 DEPC 焦碳酸磷酯。 2.5 PBS 磷酸盐缓冲盐水，配方见附录Ao 2. 6 Taq 酶 TaqDNA聚合酶。 2.7 FMDV 口蹄疫病毒。 3原理 根据口蹄疫病毒各型共有的基因特定序列的保守片段，合成一对通用的特异性引物和一条通用的 特异性探针 。荧光探针的5'端标记FAM荧光素，3'端标记TAMRA荧光素，3 ’端的淬灭基团在近距离 内能吸收5'端报告荧光基团发出的荧光信号 。但在扩增时 ，由于八他酶的5'~3 ‘的外切活性，在延伸 到荧光探针吋，将其切断，两基团分离，淬灭作用消失，荧光信号产生 。因此，可以通过检测荧光信号对 核酸模板进行检测。 4材料与试剂 4. 1仪器与器材 4. 1. 1荧光RT-PCR检测仪。 4. 1.2高速台式冷冻离心机 （离心速度12 000 r/min以上）。 4. 1.3 台式离心机（离心速度3 000 r/min） 0 4.1.4混匀器。 4. 1.5 冰箱 （2 C〜8 °C和一20 "C两种）。 4. 1.6微量可调移液器 （5 mL,10 mL,100 /丄,1 000 卩L）及配套带滤芯吸头。 4. 1.7 Eppcndorf 管 （1. 5 mL）、透明薄壁 PCR 管 （0. 2 mL）。 1 GB/T 22915 2008 4.2试剂 4.2.1除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器(用DEPC 水处理后高压灭菌)分装。 4.2.2三氯甲烷。 4.2.3异丙醇：一2OC预冷。