6PCR技术及其应用.pptVIP

父’ 父 子 母 现 嫌1 嫌2 嫌3 思考题: 1)从PCR的基本原理和特点, 论述其应用价值. （5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。 2）循环参数 变性 使双链DNA解链为单链 94oC 20-30秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。 （3）延伸 70-75℃,一般为72℃ 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加 经典循环参数（1000bp以内） 94℃ 30s 55 ℃ 45s 72 ℃ 1min 94℃ 5min ×30次 72℃ 7min 4℃ forever 1）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究 PCR的类型 高浓度引物 低浓度引物 2)反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。 已知序列 未知序列 未知序列 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 连接酶 3）多重PCR（复合PCR） 用于检测特定基因序列的存在或缺失。 电泳 引物 1 2 3 4 1 2 3 4 DMD：人类肌营养不良基因 A：无外显子8,12,17,19对应条带,说明病人外显子8～19缺失 B：病人A中未扩增外显子带的强度为C的一半,提示为区域缺失携带者 C：正常人DMD基因外显子的一般扩增形式 多重PCR检测DMD基因缺失 4）ＲＴ－ＰＣＲ 逆转录酶 ＤＮＡ聚合酶 mRNA cDNA 杂化双链 PCR扩增 基因 mRNA 蛋白质多肽链 9) 荧光定量 PCR（real-time PCR) 通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标 记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。 荧光定量 PCR仪 光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪,通常配有电脑系统及相应的分析软件。 荧光定量PCR标记方法 内掺式染料 SYBR Green I 序列特异性探针 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) 引物特异性探针 Amplifluor (Intergen) 5’ 3’ 5’ 3’ SG Excitation SG SG SG SG Emission SYBR-Green I 5’ 3’ 5’ 3’ SG SG SG SG SG Excitation Emission SYBR-Green I R Q 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Excitation R Q Q R Q R Excitation 双标记探针（Taqman Probe） 荧光定量实时PCR与普通PCR的比较 实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控,能够实时地观察到产物的增加,直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合,提高了PCR反应的特异性 增加定量的精确性 全程监控,准确的算法进行定量 结果分析更加快捷方便,无需跑胶 全新4通道实时荧光定量PCR仪 普通梯度PCR仪 PCR技术的应用 1) 基因克隆 重组DNA 质粒DNA 基因片段 大肠杆菌 胰岛素 重组体 + 胰岛素基因 基因工程产品 2)基因检测 A’ 内源性病变基因 正常人 A 病 人 病原微生物基因 正常人 (-) 病 人 (+) 遗传病的