GB/T 22333-2008日本乙型脑炎病毒反转录聚合酶链反应试验方法.pdf

ICS 11.220 B 41 OB 中华人民共和国国家标准 GB/T 22333—2008 日本乙型脑炎病毒 反转录聚合酶链反应试验方法 Reverse transcription polymerase chain reaction for Japanese B encephalitis virus 2008-08-22 发布 2008-12-01 实施 发布 GB/T 22333—2008 前 言 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位:农业部兽医诊断中心。 本标准主要起草人：王宏伟、孙明、王传彬、陈西钊、出克恭。 T GB/T 22333—2008 日本乙型脑炎病毒 反转录聚合酶链反应试验方法 1范围 本标准规定了日本乙型脑炎病毒核酸的反转录聚合酶链反应试验的技术要求。 本标准适用于动物脑组织中日本乙型脑炎病毒核酸的检测。 2试剂 2. 1变性液（见第A. 1章）。 2.2 2 mol/L 乙酸钠溶液（pH4.0 ）。 2.3酚-三氯甲烷-异戊醇混合液 （见第A. 2章）。 2. 4 2. 5 mmol/L dNTPo 2. 5 8 mmol/L上下游引物混合液 （引物序列见第A. 3章）。 2.6 10倍PCR缓冲液。 2.7 1%漠化乙锭 （EB）溶液。 2.8 TAE电泳缓冲液。 2.9 1%琼脂糖凝胶。 2. 10上样缓冲液 （见第A. 4章）。 2. 11其他试剂：10 U/mL AMV反转录酶JOObp DNA分子质量标准物、50 U/ML RNA酶抑制剂、 5 U/（«L Tag DNA聚合酶、异丙醇、75%乙醇溶液、25 mmol/L氯化镁溶液、DEPC ‘处理过的无菌双 蒸水。 3实验室条件 3. 1实验室级别要求 实验室必须为生物安全皿级（BSL-3级）实验室。 3.2实验室分区 RT-PCR试验区域分反应液配制区 （配液区）、核酸提取区、扩增区、电泳区 。流程顺序为配液区* 核酸提取区 -扩增区 f电泳区 。严禁器材和试剂倒流。 3.3实验室应配备的仪器及耗材 3.3.1仪器:分析天平、高速离心机、真空干燥器、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫 外分析仪）、液氮罐或一70 C冰箱、微波炉、组织研磨器、一20 C冰箱、水浴锅、可调移液器 （最大量程分 别为 2 IJ.L 、20 卩L 、200 “L 、l 000 卩L）。 3.3.2 耗材：眼科剪、眼科银、称量纸、10 mL —次性注射器、1. 5 mL灭菌离心管、0. 2 mL薄壁PCR 管、琼脂糖、500 mL量筒、500 mL锥形瓶、吸头 （10卩L 、200 卩L 、1 000 / 」L）、灭菌双蒸水。 4操作程序 4. 1样品的采集及处理 4.1.1样品的采集：濒死动物、扑杀动物或流产胎儿取脑组织。 4.1.2样品的处理：每份样品分别处理。 GB/T 22333—2008 4. 1.2. 1组织样品处理：取待检脑组织病料约0. 05 g置研磨器中剪碎并研磨 ，加入400 yL变性液继 续研磨 。取已研磨好的