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AAV病毒包装 摘要 : (一) AAV-293细胞的冻存 (二)AAV-293 细胞的传代 (三)AAV-293 细胞的复苏 (四)AAV包装和浓缩 (一) AAV-293细胞的冻存 随着传代的次数增加，AAV-293细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 1、去掉 细胞培养上清液，加入PBS 洗去残留的培养基; 2、加入0.25%的胰酶，消化1~2min 后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。 3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃ 预热的 10% DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6-8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mLeppendorf管中，加入 450ul 10% DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板中计数。计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。计数时，4 大格均计数，总数除以 4(得每大格细胞数)，再乘以 10(10 倍稀释)，即为实际 n 万/mL 细胞浓度。 4、细胞离心，1000 rpm/min，5min。去掉上清。 5、根据细胞计数,结果加入细胞冻存液(70%完全培养基+20%FBS+10%DMSO)重悬细胞，密度为3 x 106 个/ml。 6、分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80℃超低温冰箱。 7、第二天将细胞放于液氮罐中长久保存，并作记录。保存过程中，要不时复苏细胞检测细胞存活率，观察细胞状态等。 (二)AAV-293 细胞的传代 当细胞生长到汇合率达到 80%~90%时需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。 1、消化细胞，方法同细胞冻存。 2、细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。 3、根据具体情况，将细胞分到10cm 培养皿中，每个培养皿补足到10ml 培养基。 (三)AAV-293 细胞的复苏 当细胞传代次数过多，细胞状态变差时，或者细胞出现污染事故时，需要丢弃并对最初冻存的细胞进行复苏。 1、设置温度为37~42℃的水浴。 2、查看细胞库记录，根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞(需戴上棉手套，防止被冻伤)，迅速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在1~2min 内使细胞溶液完全 溶解。 3、将细胞溶液转移到15ml 离心管中，并在其中加上1ml 新鲜的完全培养基，混匀后离心，1000 rpm/min，5min。 4、去掉上清，加入5ml 新鲜的完全培养基，混匀沉淀后，转入6 cm 培养皿。 5、将培养皿平稳放入37℃、5% CO2 和95%相对湿度的培养箱中培养。 6、第二天观察细胞存活率。给细胞换一下培养基。以后每天观察细胞生长情况。 (四)AAV包装和浓缩 1. 质粒扩增 构建好的AAV载体、包装质粒和辅助质粒需经过大量抽提， 浓度大于1ug/ul，A260/280 在1.7-1.8 间方可用以包毒。推荐使用Qiagen 大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提。 2. 传AAV-293细胞 将培养AAV-293 细胞T75 瓶中的培养基吸净，加入2mL 4 度冰箱取出的0.25%胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于37 度培养箱中3-5min，取出，摇晃可发现细胞于底部脱离，将其全部晃下，加入3mL 37 度水浴中预热的10% DMEM，移液枪用10mL 移液管进行吹打，较大力吹打6-8 次即可，不留死角，瓶口处较难吹打可将移液管对准培口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取50ul 混匀后的细胞于1.5mL eppendorf 管中，加入450ul 10% DMEM，即为10 倍稀释，混匀，取10ul 细胞于计数板中计数。计数板上共4 大格，每大格16 小格。计数时，4 大格均计数，总数除以4(得每大格细胞数)，再乘以10(10 倍稀释)，即为实际n 万/mL 细胞浓度。传代当天记为第一天，若第二天进行转染，铺900-1000 万/T75;若第三天转染，铺350-400 万/T75。每瓶T75 加10mL 10%DMEM 培养基。转染当天观察细胞密度，80-90%满即可进行转染。转染前无需换培养基。 3. 做脂转complex 试剂名称 试剂数量 载体质粒 5ul(1.0ug/ul) 包装质粒 5ul(1.0ug/ul) 辅助质粒 5ul(1.0ug/ul) 注：LipofiterTM转染试剂为汉恒生物产品，使用说明参考LipofiterTM说明书。 4. AAV 病毒收毒： 病毒颗粒同时存在于包装细胞和培养上清中。可