邯郸-单克隆抗体完整课件.ppt

基因工程抗体常用的表达系统 一、大肠杆菌表达系统 表达外源蛋白成本低，产量大。无糖基化能力，多用来表达抗体片段。Fv、Fab、scFv。 二、昆虫细胞表达系统 可进行N、O糖基化等蛋白质翻译后加工，并能进行胞外分泌表达。表达水平是原核细胞的50-100倍。 三、酵母表达系统 是能使表达产物糖基化并可分泌胞外的最简单真核生物。目前多采用嗜甲醇型酵母—毕赤酵母。 四、植物表达系统 五、哺乳类细胞表达系统 CHO、COS、Hela、NSO。CHO细胞已成为较成熟的稳定表达系统，该系统能正确装配、折叠与糖基化等特点，分泌水平高，易大规模生产。 （五）抗体库技术制备的抗体 抗体库技术以细菌克隆B细胞克隆，利用基因工程的方法，将全套人抗体重链和轻链可变区基因克隆出来，重组到原核表达载体，通过宿主大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片段，并经过筛选后获得特异性的抗体。这类抗体可以是完全人源化的抗体。该技术摆脱了其他基因功能抗体制备工程中不可避免的鼠源性问题，成为了继单克隆技术之后抗体制备技术上的又一个里程碑。 包括组合抗体库、噬菌体抗体库和核糖体展示抗体库 噬菌体展示抗体库 噬菌体展示技术最早报道于1985年，它将外源蛋白与丝状噬菌体外壳蛋白融合，使外源蛋白表达在噬菌体颗粒表面。 其原理是将编码外壳蛋白的基因Ⅷ和基因Ⅲ与抗体基因融合表达，使表达的抗体附着在噬菌体表面，达到展示的目的，同时确保了抗体这一特定分子的基因型和表型容易在同一病毒颗粒内，即噬菌体核心DNA中含有特定蛋白分子的结构基因，并能在噬菌体表面表达该蛋白。丝状噬菌体可以识别细菌性菌毛，进而感染细菌。 噬菌体展示技术原理 1990年 Mccafferty等证明:将Ab可变区基因插入噬菌体geneⅢ中,表达出与噬菌体衣壳蛋白的N末端相连的抗体—噬菌体融合蛋白.抗体功能片段呈现在噬菌体表面,而且能正确折叠,并能与特异性Ag结合,由于有此特性,可用抗原直接筛选基因文库中任何一种所需要的抗体,使得整套抗体的分离.生产更快更容易. 噬菌体展示技术 从分离的淋巴细胞中提取mRNA mRNA逆转录为cDNA 通过PCR扩增重链和轻链 用一套特别的限制性内切酶酶解 将重链序列克隆到重链 丝状噬菌体载体中 将重链和轻链重组到 一个丝状噬菌体载体中 用抗原结合筛选噬菌斑 将轻链序列克隆到轻链 丝状噬菌体载体中 在丝状噬菌体中表达抗体的过程 综上，基因型和表型的统一使噬菌体颗粒可以作为筛选特异性抗体的介质使用；而丝状噬菌体感染大肠杆菌并可大量扩增的能力又使这种特殊的介质具有可扩增性，即先通过筛选试验从数目庞大的噬菌体群中获得与目的抗原特异性结合的有限的噬菌体颗粒，然后再由感染大肠杆菌使筛选所得的有限噬菌体颗粒获得数量上的扩增，反复几次后便可获得能与目的抗原特异性结合的大量噬菌体颗粒，这也就是噬菌体展示技术筛选抗体的原理。 ScFv噬菌体抗体库的构建流程 从人外周血淋巴细胞中提取RNA，并合成cDNA 以cDNA为模板，PCR扩增重链可变区（VH）片段 以cDNA为模板，PCR扩增轻链可变区（LH）片段 将VH片段插入噬菌体pCANTAB6 PCR扩增VH库基因 将LH片段插入噬粒pCANTAB3his6 将连接片段基因插入含轻链基因的噬粒中 PCR扩增含连接链、轻链基因的噬菌体抗体库基因 组装scFv完整基因，并加以PCR扩增，将完整基因插入pCANTAB6中构成噬菌体库 与传统的抗体制备技术相比，噬菌体抗体库技术不仅避免了耗时而繁琐的动物免疫与细胞融合过程，直接在体外进行了抗体制备，而且还能够得到一些集体处于正常状态下不易产生的抗体，如针对自身抗原及有毒的抗原的抗体。一般认为体内有10-30%的针对自身抗原的抗体因多种机制的作用无法进行反映和增殖，形成免疫耐受，但噬菌体抗体库在筛选时就没有这种限制，即利用这种技术可以轻易筛出人体内不易产生的抗体。同时细菌比细胞增殖快，培养成本低廉，利于大量制备高纯度抗体，所以噬菌体抗体库是基因工程抗体中最有前景的技术。 转基因鼠 Replace murine immunoglobulin (Ig)G genes with human IgG genes Weiner LM. J Immunother. 2006;29:1-9. Yang X-D, et al. Crit Rev Oncol Hematol. 2001;38:17-23. Mouse strain incapable of producing mouse antibodies Human Ig loci Bre