1.2--基因工程的基本操作程序.pptVIP

采用氯化钙来改变其通透性是为了制感受态细胞，原理是，用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌，此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基－钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。 目前常用的对原核细胞的转化方法有两类：电穿孔转化法、化学转化法。电穿孔转化法属于物理方法，不需要对细胞进行特殊处理，但由于受到仪器的限制，实验室更常用的是化学转化法。化学转化法是利用低温（0℃）和氯化钙（CaCl2）低渗溶液的理化处理使宿主细胞处于容易吸收外源DNA的状态，即感受态（competence），此时菌体膨胀成球形，细胞壁和膜的通透性增强。重组DNA与Ca2+形成的羟基-磷酸钙复合物黏附于菌体表面，经42℃短暂的热冲击处理（热休克）后，黏附表面的重组DNA被吸收进入宿主细胞。然后在营养丰富的的培养基上生长1小时左右，细胞形态复原，进入增殖分裂期。 细胞壁厚度因细菌不同而异，一般为15-30nm。主要成分是肽聚糖，由N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸构成双糖单元，以β（1-4）糖苷键连接成大分子。N-乙酰胞壁酸分子上有四肽侧链，相邻聚糖纤维之间的短肽通过肽桥（革兰氏阳性菌）或肽键（革兰氏阴性菌）桥接起来，形成了肽聚糖片层，像胶合板一样，粘合成多层。 肽聚糖中的多糖链在各物种中都一样，而横向短肽链却有种间差异。革兰氏阳性菌细胞壁厚约20～80nm，有15-50层肽聚糖片层，每层厚1nm，含20-40％的磷壁酸（teichoic acid），有的还具有少量蛋白质。革兰氏阴性菌细胞壁厚约10nm，仅2-3层肽聚糖，其他成分较为复杂，由外向内依次为脂多糖、细菌外膜和脂蛋白。此外，外膜与细胞之间还有间隙。 肽聚糖是革兰阳性菌细胞壁的主要成分，凡能破坏肽聚糖结构或抑制其合成的物质，都有抑菌或杀菌作用。如溶菌酶是N-乙酰胞壁酸酶，青霉素抑制转肽酶的活性，抑制肽桥形成。 细菌细胞壁的功能包括：保持细胞外形；抑制机械和渗透损伤（革兰氏阳性菌的细胞壁能耐受20kg/cm2的压力）；介导细胞间相互作用（侵入宿主）；防止大分子入侵；协助细胞运动和分裂。 脱壁的细胞称为细菌原生质体（bacterial protoplast）或球状体（spheroplast，因脱壁不完全），脱壁后的细菌原生质体，生存和活动能力大大降低。 蔡信之微生物学181页，两种理论都是假说，1、局部原生质化，也就是细胞壁上出现孔，2、好像还涉及细胞表面的转化因子（分子量5000-1--0000）的蛋白质的形成和细胞表面受体结合的转运问题。 刘祖洞得遗传书下册，174页，用钙离子处理使细胞膜上出现漏隙，DNA容易进入。 体外重组的DNA分子，需按一定的方式导入宿主细胞，通过宿主细胞的复制而使目的基因得到大量的扩增。宿主细胞也称为受体细胞，分为原核细胞和真核细胞两类。原核细胞以大肠杆菌为主，真核细胞包括酵母及动物细胞等。重组分子导入适宜的宿主细胞的过程就是转化。在基因克隆技术中，转化(transformation)特指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入宿主细胞的过程。 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）及转化 1、检测与鉴定的目的 目的基因进入受体细胞后，是否可以稳定维持 和表达其遗传特性。 步骤四：目的基因的检测与鉴定 2、分子水平的检测 检测是否插入了目的基因 检测是否转录出了mRNA 检测是否翻译成蛋白质 3、个体生物学水平的检测 ——做抗虫或抗病的接种实验 ——抗原--抗体杂交 ——DNA分子杂交技术 ——DNA--RNA分子杂交技术 * * * 步骤一：目的基因的获取 目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因。是人们所需要转移或改造的基因。 如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，植物的抗逆性相关的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。 从已有的物种中分离 人工方法合成 从基因文库获得 基因组文库 部分基因文库 利用PCR技术扩增 DNA合成仪用化学方法直接人工合成（基因小、核苷酸已知） 1、从基因文库中获取目的基因 基因文库: 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库(gene library)。 基因组文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基因，这种基因文库叫做基因组文库。 部分基因文库: 基因文库中包含了一种生物的一部分基因，这种基因文库叫做部分基因文库。 某生物体内全部DNA 许多DNA片段 受体菌群体 限制酶 与运载体连接 导入 基因组文库 某种生物某个时期的mRNA cDNA 反转