免疫组化方法和步骤.docVIP

威斯腾生物 400-675-6758 免疫组化检测CD34+的表达 1基本原理 免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过 化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。 威斯腾生物 400-675-6758 （1）1×PBS（pH 7.4，2.5L=20.0157g 137mM NaCl+0.499552g 2.68mM KCl+0 1.47mM KH2PO4+7.253337g 8.1mM Na2HPO4），115℃×15 min； （2）0.85%NaCl 500 ml=4.25 g Nacl+500 ml三蒸水，115 ℃×15 min； （3）4%多聚甲醛500 ml=20 g多聚甲醛+500 ml PBS在65 ℃水箱中3 h多，再放入4 ℃保存。 （4）DNase I buffer：40 mM Tris-HCl （pH 7.9）+10 mM NaCl+6 mM MgCl2+10 mM CaCl2； （5）Proteinase K buffer：100 mM Tris-HCl （pH 8.0）+50 mM EDTA； （6）DNase 1（原液1000 U/ml按1：99DNase 1缓冲液稀释至10 U/ml）； （7）DAB工作液（临用前配制，5ul 20×DAB+1ul 30%H2O2+94 ul PBS） （8）20 μg/ml Proteinase K工作液（按1：500稀释贮存液1 mg/ml）。 （9）另外，双蒸水、无菌0.85%NaCl、二甲苯、梯度乙醇（100、95、85、70、50%）、苏木素。 2主要仪器设备 电热压力蒸汽消毒器(XDD) 浙江绍兴医疗器械总厂 超净工作台 苏州净化设备公司 TC2323型CO2恒温孵箱 美国SHEL LAB 公司 恒温烤箱 上海跃进医疗器械厂 高速台式离心机(BACKMAN CS-15R) 美国Beckman公司 抽滤器( AUTOSCIENCE AP-01) 上海 磁力搅拌器(79-1) 江苏江阴科研器械厂 0.22um纤维素滤膜 德国BM公司 0.45um混合纤维素滤膜 德国BM公司 1/10000电子天枰(Sartorius AC-211) 德国 细胞培养瓶及细胞培养板(Costar) 美国 细胞计数板 上海医用仪器厂 光学显微镜(OLYMPUS CK-40) 日本 倒置显微镜（OLYMPUS) 日本 照像系统(OLYMPUS BH-2) 日本 切片机： 德国Leica 展片机： 德国Leica，HI1210型 烤片机： 德国Leica，HI1220型 3实验方法 3.1载玻片的处理： 抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。 1. APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。 2. HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。 3. Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。 3.2常用酶消化： 1） 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。 2） 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。 3）皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~10 g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。 3.3抗原热修复 可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原