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中药龟甲胶的质量控制方法研究刘琳 1 中药龟甲胶的质量控制方法研究 刘琳 1，张贵锋 2*，查圣华 3，孔英俊 2，高建萍 2，王明林 1*， 张宏 3，苏志国 2 （1．山东农业大学 食品科学与工程学院，山东 泰安 271018； 2．中科院过程工程研究所，北京 100190； 3．同仁堂健康药业股份有限公司，北京 100022） [摘要] 目的：研究龟甲胶酶产物的多肽组成，探索基于特征多肽的龟甲胶质量控制方法；方法：利用液质 联用技术结合酶解技术，比较龟甲胶和牛明胶酶解产物的多肽组成，筛选差异性多肽；结果：龟甲胶酶解 产物中检测出特征多肽，其对应离子分别为 m/z 856.0 和 m/z 732.7，而牛明胶中检测出的多肽(m/z 727.8 和 m/z 782.5)在龟甲胶酶解产物中未检测出。结论：龟甲胶和牛明胶酶解产物存在差异性多肽，基于特征多肽 或特征离子的龟甲胶质量控制方法具有可行性。 [关键词] 龟甲胶；质量控制；牛明胶；特征多肽；液质联用 龟甲胶是龟甲经过漂泡、煎煮和浓缩等处理并添加辅料制成的固体胶，其功效包括滋 阴潜阳、益肾强骨和养血补心等。龟甲胶主要成分为可溶性胶原蛋白及其降解产物[1-3]。近 年来随着龟甲胶等胶类中药的需求量不断上升，市场上出现了掺加牛皮胶甚至皮革降解物伪 品龟甲胶，其有效功效较低甚至产生毒副作用。研究龟甲胶中蛋白质或多肽组成并筛选特征 性多肽不仅有利于龟甲胶质量控制，而且有利于建立相应的真伪鉴别方法。 张思巨[4]等采用 IR、UV、TCL 和 HPLC 等技术研究了龟甲胶、鹿角胶和阿胶的理化性 质并尝试用于三种胶的鉴别，但由于不同动物胶的宏观性质相似，采用这些方法难以获得有 显著差异的信息。李春梅[5]等人利用 SELDI-TOF MS 分析了龟甲胶的蛋白质组成，但未比较 不同动物胶的蛋白质或多肽组成差异。其它方法如示差扫描量热法[6]、等电聚焦电泳法[7]和 圆二色谱法[8]等也曾尝试用于胶类中药的鉴别。由于胶类中药制备过程中需添加辅料且不同 厂家使用的辅料存在差异，龟甲胶在成分、分子量范围和光谱特性等性质不稳定。 龟甲胶中存在大量的胶原蛋白降解物，不同动物来源的胶原蛋白其氨基酸序列会存在 差异[9]，这些差异可作为区分不同动物胶原或明胶的依据[9,10]。本研究拟采用 HPLC-MS 结 合蛋白酶切技术比较龟甲胶和牛皮胶酶解产物中的多肽组成差异，筛选特征离子或特征多 肽，探索一种基于特征多肽的龟甲胶质量控制方法。 1 材料与方法 1.1 样品来源 龟甲胶购自北京同仁堂药店；牛明胶购自美国 Sigma 公司。 1.2 仪器与试剂 胰蛋白酶(序列纯)购自美国 Promega 公司；牛 I 型明胶购自美国 Sigma 公司， 2,4-二硝 基氟苯(DNFB)购自 Acros Organics 公司，其他试剂均为市售分析纯。液质联用系统由 Agilent 1100 HPLC 和 Thermo 公司 LCQ DecaXP 质谱组成，数据采集与处理软件分别为 Xcalibur1.3 和 Biowroks3.1。 289 1.3 1.3 实验方法 1.3.1 样品处理 称取 1 g 研磨后的龟甲胶样品，加入 20 mL 水，50℃水浴溶解，室温 10 000 r· min-1 离 心 15 min，取清液加入 20%饱和三氯乙酸，4℃保存 10 min，10 000 r· min-1 离心 15 min，收 集上清液和沉淀物。将沉淀物重新溶解于水中，调 pH8.0，加入 100 μL 胰蛋白酶 37℃酶解 12 h，采用 HPLC-MS 分析其多肽组成。 1.3.2 分析方法 1.3.2.1 凝胶过滤色谱分析 色谱柱 TSK G3000SWxL(7.8×30 cm, 5 μm)；流动相 0.02 mol· L-1 磷酸缓冲液(pH7.0)；流速 0.5 mL· min-1；进样量 20 μL；紫外检测波长 214 nm。 1.3.2.2 氨基酸组成分析 样品水解、DNFB 法氨基酸衍生和液相条件分析条件参照文献[11]。 1.3.2.3 高效液相色谱质谱联用分析 色谱柱 ZORBAX SB-C18(2.1×150 mm, 5 μm)；流动相： 水(0.1%TFA)(A), 乙腈(0.1%TFA)(B)；梯度 0~100 min，5%~40%B；100~120 min，40%~70%B； 进样量样品 20 μL；流速 0.2 mL· min-1。质谱条件喷雾电压 4.5 kV；毛细管温度为 300℃； 鞘气(N2)60 个单位；正离子模式，一级质谱扫描范围 m/z300~900,精确质量数扫描(Zoomscan) 和二级质谱(MS/MS)扫描均为数据依赖型扫描(D