细胞内氧化应激性氧单线态氧气比色法定量检测试剂盒产品.docVIP

细胞内氧化应激活性氧单线态氧气比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版） 主要用途 细胞内氧化应激活性氧单线态氧气比色法定量检测试剂是一种旨在通过二甲基-4-亚硝基苯胺，受到单线态氧气-的作用，出现去色现象，由分光光度仪比色分析，定量检测细胞内单线态氧气活性氧族的生成和增加的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老、代谢和营养学等的研究。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，检测敏感。 技术背景 超氧自由基阴离子（superoxide radical；O2-）、过氧化氢（hydrogen peroxide；H2O2）、羟自由基或氢氧基（hydroxyl radical；OH-）、过氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氢过氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HClO）、半醌自由基（semiquinone radical）、单线态氧气（singlet oxygen）等细胞内活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡。其中单线态氧气（singlet oxygen；1 O2）是分子氧（O2）的抗磁形式或电激发形式。通过染料分子，例如孟加拉红（Rose Bengal）、亚甲基兰（Methylene Blue）、卟啉类化合物（Porphyrins）染料的光敏过程中能量转移产生，或过氧化氢和次氯酸的化学反应产生。单线态氧气可以调节紫外线A辐射的生物学作用、激活各种细胞信号通路等。单线态氧气会导致植物的光动力损伤（photodynamic damage）和动物心血管问题。基于二甲基-4-亚硝基苯胺（N,N-Dimethyl-p-nitrosoaniline；PNDA或RNO）作为单线态氧气的选择性受体，在单线态氧气的存在下，产生去色作用，在分光光度仪下（440nm波长），呈现吸光峰值的降低。据此定量检测细胞内单线态氧气活性氧族的浓度。 产品内容 清理液（Reagent A） 120毫升 裂解液（Reagent B） 10毫升 缓冲液（Reagent C） 20毫升 反应液（Reagent D） 2毫升 阴性液（Reagent E） 1毫升 产品说明书 1份 保存方式 保存 清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在-20℃冰箱里； 反应液（Reagent D）避免光照；有效保证6月 用户自备 1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器 15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器 细胞刮脱棒：用于细胞脱离 （微型）台式离心机：用于样品操作 培养箱：用于反应孵育 比色皿或96孔板：用于比色分析的容器 分光光度仪或酶标仪：用于比色分析 实验步骤 样品准备 准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 106细胞） 小心加入3毫升 清理液（Reagent A），覆盖生长表面 小心抽去清理液 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化） 加入3毫升 清理液（Reagent A），混匀细胞 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始） 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g 小心抽去上清液 加入500微升 裂解液（Reagent B），充分混匀 转移到预冷的1.5毫升离心管 强力涡旋震荡15秒 置于冰槽里孵育30分钟 放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415） 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－MB30030.1） 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作 测定准备 开启并设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长440nm，并置零 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化； 反应液（Reagent D）避免光照 背景对照测定 移取800微升 缓冲液（Reagent C）到新的比色皿 加入100微升 阴性液（Reagent E） 加入100微升 反应液（Reagent D） 上下倾倒数次，混匀 在30℃温度下孵育40分钟 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照 样品测定 移取800微升 缓冲液（Reagent C）到新的比色皿 加入100微升待测样品（5