23基因工程的常规技术.pptVIP

第三节 基因工程的常规技术 凝胶电泳技术 一 凝胶电泳技术 影响琼脂糖凝胶电泳的因素： DNA片段的大小 凝胶的类型 凝胶的浓度 电泳缓冲液 电压 二 杂交技术 1975，Edwen Southern提出分子印迹概念。 概念：将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）于固定化介质上并加以检测分析的技术。目前主要应用于DNA，RNA，蛋白质的检测。 核酸分子杂交的基本原理： 具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。 杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知核酸序列称探针。 DNA印迹技术 Southern blotting 基因组DNA经限制性内切酶消化后，进行琼脂糖凝胶电泳，将含有DNA片断的凝胶放入变性溶液变性后，将硝酸纤维膜(NC)膜放在胶上，上面放吸水纸巾，利用毛吸作用使胶DNA转移质NC膜上，然后利用杂交技术检测NC膜上的DNA片断。 RNA印迹技术 Northern blotting 与Southern blotting相似，但不需要限制性内切酶切割。用于基因表达的特异性分析和定量分析。 蛋白质免疫印迹法 Western blotting: 免疫印迹法是检测蛋白质混合溶液中某种特定目的蛋白质的定性方法，也可以作为确定同一蛋白质在不同细胞或者同一种细胞不同条件下的相对含量的半定量方法。由于其检测往往需要抗体，所以也被称为免疫印迹技术。 原理：蛋白质组分经SDS分离后，平行转 移到固相支持体（NC膜或PVDF膜）上，通过免疫 试剂来检测靶蛋白。 靶蛋白的检测通常采用两步法或间接法，用一抗结 合靶蛋白，再用过氧化物酶（HRP）标记的二抗 结合一抗，然后HRP催化化学显色反应或化学发 光反应。 三 PCR技术 经典循环参数： 四 基因文库构建 作业： 简述基因工程实验中常规技术？ 引物设计： （1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以15-30 bp为宜（17 1.5×1010bp）。 （3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。 总体积 50-100 ?l Buffer 缓冲液 dNTP 原料 Primer 引物（0.1-0.5 ?mol/L） DNA分子 模板 （50-100ng ） Taq酶 DNA聚合酶（0.5-2.5 U/50 ?L ） 反应体系： 94℃ 30s 55 ℃ 45s 72 ℃ 1min 94℃ 5min ×30次 72℃ 7min 4℃ 用途广泛： 生命学科 医学工程 遗传工程 疾病诊断 法医学 考古学 基因文库的基本概念 基因文库的构建程序 基因组文库重组克隆的排序 基因文库（gene library） 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为： 基因组文库（含有全部基因） cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因） ● ● 基因文库构建的基本战略 用cDNA法构建cDNA文库，材料来自mRNA 在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA文库等。 ● 用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA ● 基因文库的构建程序 ●基因组DNA的制备 为了最大限度地保证基因在克隆过程中的完整性， 用于基因组文库构建的DNA在分离纯化操作中应尽量避免过度的断裂。制备的DNA分子量越大，经切割处理后样品中含有不规则末端的DNA片段的比率就越低，重组率和完备性也就越高。 ●基因组DNA的切割 用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶切两种方法，其目的是： 第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区 第二，保证DNA片段大小均一 * * 杂交技术 PCR技术 基因文库构