二章细胞破碎与固液分离技术.pptVIP

第二章 细胞破碎与固液分离技术 获取目的物质的先期步骤 概述 生物分离的第一步是将生物机体从发酵液中分离，通常使用过滤和离心等方法。 发酵细胞的代谢产物有的分泌到细胞或组织之外，还有许多是存在于细胞内部。 对于胞外产物只需直接将发酵液预处理及过滤，获得澄清的滤液，作为进一步纯化的出发原液。 对于胞内产物，则需首先收集菌体，进行细胞破碎，使代谢产物转入液相中，然后，再进行细胞碎片的分离。 大多数情况下，抗生素、胞外酶、一些多糖及氨基酸等目标产物存在于在发酵液中。 使胞内产物释放出来一般需要破碎细胞壁。细胞破碎的方法在生物化学领域中得到了很广泛的运用，但多数在小规模生产中，在大规模生产尤其是基因工程中应用极少。 目的 破碎目的是使产物最大限度的释放出来 同时，细胞破碎需要考虑对后期分离的影响。 材料和产物的特性、提纯要求是选择破碎方法的依据。 破碎方法的选择 选择的一般原则 A、提取产物在细胞质内，用机械法破碎 B、提取产物在细胞膜附近，用化学法 C、提取产物与细胞膜或细胞壁结合，可采用化学法和机械法结合的方法 破碎过程中应注意的问题 A、多种破碎方法相结合可产生很大优势 B、对下游分离技术的影响：破碎颗粒清除，产物分离纯化 C、在上游发酵阶段，考虑到发酵过程和环境对破碎难易程度影响 D、菌种的培育及改造，胞内产物 ? 胞外产物 细胞结构与破碎 为了破碎细胞，必须克服的主要阻力是网状结构的共价键。 在用酶法或化学法来溶解细胞壁时，细胞壁的结构和组成显得特别重要，可用来作为选择溶菌酶和化学方法的依据。 细胞破碎技术 破碎技术 1、机械法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破碎的方法，常用的器械有组织捣碎机、匀浆器、研钵和研磨、压榨器等。 破碎技术 2、物理法 （1）反复冻溶法 原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。 方法：将待破碎的细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 特点：此法适用于组织细胞，多用于动物性材料，对微生物细胞作用较差。 （2）急热骤冷法  将材料投入沸水中，维持85-90分钟，至水浴中急速冷却，此法可用于细菌及病毒材料。 （3）渗透破碎法 利用细胞内外渗透压差使水分进入细胞而破碎。 3、化学及生物化学法 自溶法和酶溶法利用自身或制备酶对细胞进行破碎，需要进行适当处理。 酶溶法适用性广、温和且可控。 化学法利用有机试剂改变细胞壁或膜的通透性，也较温和，但效率低，易造成污染。 比较 这些方法中，化学及生物化学法较温和，细胞破坏后产物多数不会发生不可逆的变性，规模也容易放大，生产中最常用。机械法剪切力破坏较大，产生热量，而且不容易规模放大，但设备较成熟，也常用；物理法处理量少，只用于实验室。 破碎率的测定 1、直接测定法 设备：显微镜、电子微粒计数器 破碎前细胞数 破碎后细胞数：用染色法排除释放物对计数的干扰。 如：碎的G+可染色呈G-的颜色。G染色法受损酵母亮红色，未损酵母呈紫色。 目的产物测定法 测定释放的蛋白质量或酶的活力。通常将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中蛋白质的含量或酶的活力，并与所获得的标准数值直接比较。 测定导电率 原理：细胞破碎后，大量带电荷的内含物释放到水相，电导率上升，而与破碎率的增加呈线性关系。 先制定标准曲线：微生物的种类、处理的条件、细胞浓度、温度和悬浮液中电解质的含量 在同等条件下测其电导率，计算破碎率。 固液分离 固液分离将两种不同状态的物质进行区分，以便于后续工作，是重要的基础环节。 生物分离工作的一般过程 过滤 利用一种能将固体微粒截留而让流体通过的多孔介质，将固体微粒从气体中或液体中分离出来。 过滤介质 织物介质：最常用的过滤介质，工业上称为滤布(网)，由天然纤维、玻璃纤维、合成纤维或者金属丝编织而成。可截留的最小颗粒的直径为5-65微米。 多孔固体介质：具有很多微细孔道的固体材料，如多孔陶瓷、多孔金属及多孔性塑料制成的管或板，能截留1-3 ?m的微小颗粒。 堆积介质：由沙、木炭之类的固体颗粒堆积而成的床层，称作滤床，用作过滤介质使含少量悬浮物的液体澄清。 多孔膜：用于膜过滤的各种有机分子膜和无机材料膜。 过滤推动力 过滤推动力是指滤饼和过滤介质两侧的压力差。此压力差可以是重力或人为压差。增加过滤推动力的方法有： 1、增加悬浮液本身的液柱压力，一般不超过50KN/m2，称为重力过滤。 2、增加悬浮液液面的压力，一般可达500KN/m2称为加压过滤。 3、在过滤介质下面抽真空，通常不超过真空度86.6KN/m2，称为真空过滤。 此