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第三节 特殊用途的载体 一、插入或定点整合突变载体 (一)基因定点插入/基因敲除载体 将外源基因与靶细胞基因组DNA的同源序列进行同源重组， 使某一位点的基因发生定点突变 (二)随机插入突变载体 1.T-DNA插入突变载体 如：pFX-E24.2-15R 2.转座子插入突变载体 如：pEG922 二、启动子探针型表达载体 特点： 具有一个无启动子的易检测的基因。这种基因必须满足一个重要条件：基因编码区5‘端可以作较大的修改而不影响其产物的活性。 LacZ, GUS, Kanr基因可以满足该要求。在大多数载体中，检测基因不仅被除去了启动子序列，其翻译起始区也被除去（II型），有的则仅仅除去了转录起始区 （I型）。 用途： i. 分离未知基因的启动子—Ⅱ型启动子探针型载体 ii.鉴定已知基因的启动子和比较其强弱—Ⅰ型启动子探针型载体 二、启动子探针型表达载体 启动子探针型载体结构 三、RNAi载体 RNA interference（RNAi） 是指将外源双链RNA(double—stranded RNA，dsRNA)导人细胞后引起与其序列同源的特异基因mRNA 降解的现象，属于转录后基因沉默 (post—transcriptional gene silencing，PTGS)的一种形式。 三、RNAi载体 RNA interference（RNAi） 三、RNAi载体 紫色为正义RNA段，蓝色为反义RNA段，绿色为目标信使RNA，dsRNA触发了高效的基因沉默机制并极大降低了靶mRNA水平，达到干扰目的 RNAi的机制 三、RNAi载体 商品化载体的siRNA策略示意图 小结 几种基因载体的比较 质粒* 受体细胞 结构 插入片断 举例 E.coli 环状 ＜ 8kb pUC18/19 , T-载体pGEM- 3z等 λ噬菌体 E.coli 线状 9 - 24kb EMBL系列， Λ gt系列 丝状噬菌体及噬菌粒 E.coli 环状 ＜ 10 kb M13mp系列 粘粒载体 E.coli 环状 35- 45kb pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV BAC (Bacterial Artificial Chromosome) E.coli 环状 ≈300 kb Pel oBAC系列 PAC (P1-derived Artificial chromosome) E.coli 环状 100 - 2000 kb PCYPAC1 YAC (Yeast Artificial chromosome ) 酵母细胞 线性染色体 100 - 2000 kb MAC (Mammalian Artificial Chromosome) 哺乳类细胞 线性染色体 ＞ 1000 kb 病毒载体 动物细胞 环状 SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体 穿梭载体 动物细胞 和细菌 环状 pSVK3质粒，PBV, Ti质粒 本章重点掌握的内容 掌握载体、克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、α-互补、插入失活、人工染色体载体的概念。 克隆载体DNA分子具备的条件。 标记基因的分类及其作用。 pUC18/19质粒载体的组成、优点及质粒克隆载体用途。 λ-DNA载体的构建、类型及其优点。 植物表达载体的组成、启动子的类型等 OVer!!!!