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第五章 鱼精的利用 自鱼精中提取DNA-Na 鱼精蛋白 一、自鱼精中提取DNA-Na （一）、概述 DNA及其钠盐（DNA-Na）是遗传工程研究的重要材料，也是常用的生化试剂和医药制品的原料。由DNA降解而成的5′—脱氧核甘酸，在遗传工程上可用来合成一级结构模拟药物，在临床上能控制一些贵遗传复制失调的疾病；在医药学上，可作为类抗病毒物，能起到调节细胞功能，对治疗急慢性肝炎、肾炎、肌肉萎缩、心血压计管病、血小板减少症和白血球减少症均有一定疗效；还可作为一类抗癌新药畏助应用于临床。 DNA的制备历史： 在五十年代是Zamenhoff等用不同方法从生产牛肉膏的下脚料小牛胸腺中提取的，后来牛肉膏被蛋白胨取而代之。 人们开始不断地探寻新的生产原料和方法。/国外亲从各种微生物中分离制取过DNA，但由于原料来源不便，未能广泛采用。 1972年德国专利报告了鲱鱼精巢DNA的制备。 在我国，早在1958年，中国科学院、上海鱼品厂等就以黄鱼精巢为原料制取了DNA-Na。80年代前后，浙江水产学院分别由鲐鱼、蓝圆鲹、大黄鱼和马面的精巢中提取了DNA-Na，并对其制备工艺进行了成功的筛选研究。 （二）、原料 制备DNA的原料应该符合下列几个条件： 1、DNA含量高而且不源方便； 2、原料内活性去氧化核糖核酸酶的含量应该低，否则在原料贮藏及制备过程中，引起DNA的解聚作用； 3、原料中其它杂质，如RNA、杂蛋白质及碳水化合物等含量要少，否则使提纯过程延长； 4、DNA与蛋白质之间的结合强度应该是较弱的，否则难以分离DNA与蛋白质，在用变性剂去蛋白质时，往往要重复多次主能把蛋白除尽。多年来的实践证明，除了犊牛胸腺外，水产品中，淡水鱼，鱼等精巢均是较理想的原料，其次为蓝圆、大黄鱼和马面鱼精巢。 根据上面四个原则，很自然地提出了对原料新鲜度的要求，因为新鲜的才不会被解聚。而要想达到DNA含量高的要求，则必须在适当的生长时期采集，并且要设法抑制Dnase的解聚活力。 （三）、DNA-Na提取工艺 制取DNA-Na的具体方法很多，但各种方法最根本的均可归结为下面几步： 第一步：借机械或化学的历代法把组织的细胞破坏，并从中分离出纯净的DNA-蛋白质。 第二步：以DNA-蛋白质为原烂漫，把它分成DNA与蛋白质两部分。 第三步：把DNA部分由离心分出（离心液），并对其重复纯化，去除蛋白质等杂质。 第四步：将DNA钠盐干燥。 酚与CHCL3-5%SDS复合法，是浙江水产学院在吸取国外各种方法长处的基础上，经筛选改进而提出的适合工业化生产的制备工艺，它具有产率高，质量稳定，操作方便，周期短，成本较低诸优点。 工艺流程 原料 → 匀浆 → 搅拌→ 酚法变性 → 静置 → 离心或过滤 → 用5%SDS与CHCL3作第二次变性 → 离心或过滤 → 析出DNANa纤维 → 洗涤 →真空干燥 → 产品检验→ 成品及其包装 操作要点： 1、原料处理 对新鱼或冻藏鱼精除去污物和结缔组织。 2、匀浆 以原料与高盐溶液（2MnaCL-0.015M柠檬酸三钠溶液）比为1:3加入高盐液，以12000r/min×1′45″匀浆。 3、第一次变性 以原料与酚饱和溶液比为1：0.8后加速离心（3200r/min×30′） 4、第二次变性 取上述离心后的上清液稀释至20-30倍（以鱼精原料为基础程），加紧入其1/9体程（以20倍稀释时）的混合变性剂（5%SDS ，CHCL3=1：2），同时加入固体NaCL，使整个体系氯化钠浓度保持1M。搅拌变性1h后，静置6-12h，离心。 5、DNA-Na的析出、洗涤和干燥 将二次变性后所得的上清液，徐徐倾入1倍体积的95%乙醇中，用两个容器往复倾倒几次，纤维状的DNA-Na就析出，将析出的DNA-Na依次用95%的乙醇、丙酮和无水乙醇洗涤二次后，迅速用P2O5进行真空干燥。 （四）、5′-脱氧核酸的分离与精制 工艺流程： 鱼精DNA-Na → 配成1%（w/v）溶液 → 100℃沸水浴热变性10分钟 → 速冷 → 72℃±0.5酶解1.5h 升温至100℃，10min → 速冻 → 过滤 → 滤液（测酶解率） →上201×8柱（同时脱氧核苷等穿漏）→用不同洗脱液脱分离（洗脱顺序为Dcmp dAMP TMP dGMP） →收集的各种洗脱液用炭柱浓缩→ 一级真空浓缩 → 冷冻升华干燥→ 两级真空浓缩 → 用冷酒精析出→ 洗涤→结晶 → 真空干燥→ 结晶成品→ 成品检验。 方法要点 1、核酸酶P1用P. citrinum M71 经紫外线变异筛选后的菌株，采用液体培养制得的，滤过液酶活每ml对DNA在100单位上下，对R