人凝血因子Ⅷ效价测定二步法.doc

人凝血因子Ⅷ效价测定二步法 1　材料 1.1试剂 1.1.10.05mol/L　CaCl2溶液 称7.35gCaCl2·2H2O（分析纯），加蒸馏水溶解，稀释至1000ml。 1.1.20.025mol/L　CaCl2溶液 称3.675gCaCl2·2H2O（分析纯），加蒸馏水溶解，稀释至1000ml。 1.1.3　咪唑缓冲液 称0.68g咪唑和1.17gNaCl，溶于约100ml蒸馏水中，加37.2ml0.1mol/l　HCl，加蒸馏水至200ml，pH为7.3～7.4。 1.1.4　枸橼酸盐-氯化钠溶液 1份3.8%枸橼酸三钠溶液加5份0.85%NaCl溶液混匀。 1.1.5Al(OH)3胶 a称（NH4）2SO45.5g，溶于150ml63℃蒸馏水中。 B称氨明矾19.175g，溶于250ml58℃的蒸馏水中。 C最取12.5ml氨水（比重0.88），加12.5ml蒸馏水。 三种溶液配毕后，立即将c液迅速倒入a液中搅匀，然后在搅拌下将此混合液迅速倒入b液，用力搅拌10分钟（保持温度不低于58℃），离心（2500r/min，15分钟），弃上清，沉淀洗涤5次。 第一次：用75ml蒸馏水加0.055ml氨水（比重0.88）混匀，离心，弃上清。 第二次：用75ml蒸馏水加0.11ml氨水（比重0.88）混匀，离心，弃上清。 第三、四、五次分别用75ml蒸馏水洗。 将沉淀物悬浮于总体积为175ml蒸馏水中，混匀，分装，4℃保存。 1.1.6　正常人血清 分别收集20份以上正常人血于干燥灭菌的玻璃瓶中，待血凝固后，放于37℃保温5～6小时，置4℃冰箱过液，分离血清，混匀，定量分装（0.5ml/安瓿），冷冻干燥，-20℃保存。 用时，取冻干品1支，按标示量加蒸馏水溶解，然后用咪唑缓冲液作1∶10稀释，4℃冰箱过夜（使血清活化），试验当日再用咪唑缓冲液作最适浓度稀释（一般为1∶20），置冰浴备用。 1.1.7　牛Ⅴ因子 收集公牛血于干燥灭菌的玻璃容器中，室温放置4小时，离心（2500r/min，30分钟），分离血清，取血清加10%（g/ml）BaSO4在室温下搅拌吸附40分钟，离心（2500r/min，40分钟），弃沉淀，定量（1ml/瓶）分装，冷冻干燥，-20℃保存。 用时取冻干品1支，按标示量加蒸馏水溶解，用生理盐水作最适浓度稀释（一般为1∶20），置冰浴备用。 1.1.8　磷脂 取新鲜脑（人，牛，兔），除去表面血管、脑膜，尽可能除去白质，切成薄片，称重，轻轻捣碎，用3倍脑组织的丙酮提取5次，每次用双层绸布滤干，最后脑粉于37℃干燥1小时，称取脑粉1g，加20ml氯仿提取，于室温振摇2小时后，用单层滤纸过滤，滤液放抽气柜内用吹内机吹至微干，加10ml生理盐水研制成白色均匀乳状液，定量（0.1ml/瓶）分装，冷冻干燥，-20℃保存。 用时，取冻干品1支，按标示量加蒸馏水溶解后，用盐水作最适浓度稀释（一般为1∶100～1∶500），置冰浴备用。 1.1.9　基质血浆 正常枸橼酸血浆，按3ml分装，-20℃保存。 1.2标准品和样品。 2　操作 2.1试剂混合 取稀释人血清、Ⅴ因子、磷脂等量混合，置冰浴30分钟后备用。 2.2标准品、样品的准备和稀释 2.2.1　若试验血浆对标准血装（标准血浆为未吸附者）：二者按1ml血浆加0.1ml　Al(OH)3悬浮液混合，置37℃水浴吸附3分钟，离心取上清备用。 2.2.2　试验血浆对浓缩标准或试验浓制品对标准血浆：用Ⅷ因子严重缺乏的血浆（Ⅷ因子含量＜1%）稀释浓缩标准品或试验浓制品使成0.5～1.0IU/ml，然后按2.2.1法进行吸附处理。 2.2.3浓缩试验品对浓缩标准品：直接溶解稀释成0.5～1.0IU/ml。 2.2.4标准品和检品准备好后，立即用枸橼酸盐一氯化钠溶液分别作3个连续倍倍稀释，使最低和最高稀释度的凝结时间在17～35秒间（一般为1∶16～1∶256） 2.3　测定 2.3.1　第一步，混合物的保温 取7支玻璃凝集管放入冰浴中，每管加0.3ml混合试剂，然后于第1、2、3管分别加高、中、低稀释度的标准品各0.1ml，第4、5、6管分别加高、中、低稀释度的样品各0.1ml，第7管加枸橼酸盐-氯化钠溶液0.1ml（作空白）；从第1管开始逐管移入37℃水浴，加0.05mol　/L预温CaCl2溶液0.1ml，混匀，记时。每管移入37℃水浴及加CaCl2溶液的时间间隔均为1分钟。 2.3.2　第二步，凝血酶原激活物生成量的测定（取样时间以15分钟和21分钟为例） 另取13支凝集管，每管各加入0.025mol/l　CaCl2溶液0.2ml，当第一步第1管保温至12分钟时，将此13支凝集管和1支装有基质血浆的试管放入37℃水浴中，待混合物保温至14分钟40秒时，从第1保温管中取出0.1ml