westernblot原理及操作流程.pptVIP

WB实验技术及常见问题分析 2011-5-7 Western blot 定义 Western Blot中文一般称为蛋白质印迹 通过聚丙烯酰胺电泳根据分子量大小分离蛋白后转移到杂交膜上 分离的蛋白可以通过一抗/二抗复合物进行检测 是蛋白质分析的最流行的技术之一 Western Blot操作流程 蛋白样品的制备 （蛋白抽提、定量） SDS-聚丙烯酰胺 凝胶电泳 （SDS凝胶制备、上样） 一、蛋白样品的制备 水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液 对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 细胞裂解液： 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 ， 0.05% PMSF ， 2μg/mL Aprotinin, 0.5μg/mL Leupeptin ， pH8.0 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。 二、蛋白样品的定量(Bradford法 ) 原理—考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。 制作标准曲线 （插入表格） 检测样品蛋白含量：取一管考马斯亮蓝+95 ?l 0.15mol/L NaCl NaCl溶液+5?l待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入比色杯中测试。 分离的蛋白通过电转膜方式从凝胶中转移到杂交膜上（PVDF或NC膜） 五、封闭 脱脂奶粉（含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液 ） BSA Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供） 把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，加入一抗溶液与滤膜温育，室温小时或4℃过夜。 倒掉一抗溶液，用PBS漂洗滤膜3次，每次10min。 加入配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 室温一小时或4℃过夜。 倒掉二抗溶液，用PBS漂洗滤膜3次，每次10min。 Western Blot 需要的主要试剂 WB需要试剂－膜 常用的有PVDF膜，硝酸纤维素膜或者尼龙膜 WB需要试剂－封闭试剂 BSA或者脱脂奶粉(光明脱脂奶粉) 商业化的封闭试剂 WB需要试剂－一抗 选择适合检测标本种属的一抗（说明书有验证） 选择适用于WB实验方法的一抗（说明书有验证） 选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体 根据说明书推荐的浓度优化最佳稀释比例 杂交需要试剂－二抗 二抗选择：根据一抗来源种属以及抗体Ig亚型选择合适的二抗。 二抗的使用： 根据说明书推荐浓度使用TBST稀释二抗。 如果说明书没有推荐浓度，可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度（1:1000-1:20000）。 孵育条件一般为室温1-2小时。 杂交需要试剂－底物 显色底物：操作简单，灵敏度低，如TMB、DAB、BCIP/NBT 化学发光底物：灵敏度高，需要曝光检测设备（暗室、曝光设备和胶片）或者凝胶成像设备。 WB常见问题 没有信号 高背景 非特异性条带 条带大小不对 没有信号/弱信号 背景高 非特异性条带 * * 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 20-30 ug 细胞/组织裂解物 100 ng 纯化蛋白 根据蛋白表达丰度调整适当的蛋白上样量 上样量一致：每孔上样量保持一致 上样前用loading buffer加热变性样本 三、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 Anode - 内槽缓冲液带有负电荷，与凝胶顶部接触 外槽中缓冲液带有正电荷，与凝胶底部接触 Cathode + 带有负电荷的蛋白质从上到下运动（负极到正极），分开 电泳进程可以根据前沿指示剂来确定，等其跑到底部上面1cm左右即可停止电泳 小分子量蛋白跑的比较快. 蛋白根据分子量大小分开 蛋白质带有负电荷，因此电泳时可以从负极向正极移动 标本加入到上样孔中 四、Western Blot 转膜 PVDF膜：价格较贵，可重复使用，特别适合蛋白印迹，结合能力较强，但价格比较昂贵。 NC膜（硝酸纤维素膜）：价格比较便宜，应用较广，结合牢固性差一些，韧性也不如PVDF，不能重复使用，但蛋白吸附容量高，亲水性较好。 六、一抗、二抗孵育 七、二抗与底物反应显色 ECL化学发光显色 比较常用，结果容易控制，但是被催化是 灵敏度差一点 DAB显色 比较灵敏，是HRP最敏感的底物 主要目的是确定靶蛋白的分子量大小；使用预染的Marker还可以实时检测电泳分离情况，并可以转移到膜上。 WB需要试剂－蛋白质Marker Prestained protein