第5章噬菌体载体和柯斯载体.pptVIP

第五章 噬菌体载体和柯斯载体 本章主要内容 噬菌体一般特性 λ噬菌体 柯斯质粒 M13噬菌体 1、M13噬菌体特性及基因组结构 2、M13噬菌体载体类型及特点 噬菌粒 二、噬菌体的感染性 噬菌体的感染过程 三、噬菌体的溶菌生命周期 噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期 只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。 烈性噬菌体溶菌生长的基本过程： 1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来 四、噬菌体的溶源生命周期 溶源生长周期：是指在感染过程中没有产生出子代噬菌体颗粒，噬菌体的DNA是整 合到寄主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分。 现知道只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期 整合：噬菌体的DNA是被包容在寄主细胞染色体DNA中 原噬菌体：在溶源细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体 超感染免疫性：溶源性细菌不能够被头一次感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染。 2、溶源周期的主要特征 λ噬菌体和P1噬菌体 λ噬菌体的特征： (1) 噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 (2) 经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是转录活性便被一种阻遏物所关闭 (3) 噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，变成原噬菌体 (4) 细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色体的一部分进行复制。 3、超感染免疫性 （1）溶源细菌的两个重要特点： 不能被头一次感染的噬菌体再次感染，称为超感染免疫性； 经过许多世代以后，溶源性细菌可以进入溶菌周期，称为溶源性诱发。 ① 超敏感免疫性 阻遏－操纵体系：cⅠ基因编码阻遏蛋白，启动子PL和PR，操纵基因OL和OR 五、重组噬菌体的分离 第二节 λ噬菌体载体 1、λ噬菌体特性及基因组结构 2、λ噬菌体载体类型及特点 cos位点的两个作用： 使进入细菌的DNA分子成为环状 ，这是插入细菌基因组的先决条件。 作为识别位点，由内切酶将滚环复制的多联体DNA切开 感染早期：从单一复制起点开始双向θ型复制，由O基因和P基因产物激活； 随后开始滚环复制，产生的线性DNA为基因组首尾串连的多联体DNA分子 ② 溶源化控制基因——att int xis Xis：控制一种蛋白质删除酶的合成 int：控制整合酶的合成 att：提供整合酶的识别位点 ③ 控制基因 cIII、N、cI、cro、cII ④ 溶菌基因——S、R Lac Z基因插入失活：如charon16A，λgt 11载体，在非必需区段引入lac Z基因，在lac Z基因上有EcoRⅠ位点，插入失活后利用X-gal法筛选（兰白筛选）。 在λNM781替换型载体中，可取代的EcoRⅠ片段，编码有一个supE基因（大肠杆菌突变体tRNA基因），这种λNM781噬菌体感染细胞后，寄主细胞lacZ基因的琥珀突变被抑制，因此能在X-gal琼脂培养基上产生出蓝色的噬菌斑。 如果这个具有supE基因的EcoRⅠ片段被外源DNA取代了，那么所形成的重组体噬菌体，在上述指示培养基上只能产生出无色的噬菌斑。 三、 λ噬菌体载体的改良 改良的目标： 扩大克隆容量 设计可对重组体分子作正选择的克隆载体 构建可以方便的通过转录作用制备外源DNA插入序列之RNA探针的克隆载体 发展可以使插入的真核cDNA与β－半乳糖苷酶形成融合蛋白的克隆载体 1、Spi-正选择的λ噬菌体载体 λ1059、λL47.1 Spi-重组体的筛选 野生型λ噬菌体不能在携带有P2原噬菌体的溶源菌中生长，λ的这种表型称为Spi+(对P2的干扰敏感) 但是当λ基因组中缺少参与重组的两个基因red和gam时，λ突变体可以在P2溶原菌中生长，其表型称为Spi-。 基因red和gam位于非必需区域内，外源DNA片段能置换基因red和gam形成重组体，其重组体不能在recA-的P2溶源菌中繁殖 可以在recA＋的P2溶源菌中繁殖并且显示出Spi-的表型。因此只要选用recA+的P2溶源菌作为宿主菌，就可以对重组体进行筛选。 λDNA的复制是由θ型向滚环型的转变，受到gam基因控制 基因gam功能：蛋白产物和寄主细胞的外切核酸酶Ⅴ（宿主recB和recC基因产物）结合成复合物，失去对λDNA的作用活性，因而λ噬菌体能够合成成熟的多联体DNA，供作包装底物 基因red功能：参与裂解性生长早期发生的重组反应，是核酸外切酶，使θ型复制中的病毒DNA分离形成子代闭环DNA分子 recA＋的P2溶原菌 red-gam-：利用大肠杆菌的重组酶（recA＋），通过单体λDNA间的