紫外可见分光光度法第2章.pptVIP

紫外可见分光光度法 紫外—可见分光光度法(UV-VIS)操作简便、快速、准确度较高，同时由于仪器价格相对较低，因此在体内药物分析中应用广泛。 但由于该方法不具备分离能力，使得其专属性在体内药物的测定中受到一些影响，但如能配合适当的分离手段，如溶剂提取或层析分离，或采用一些特殊的分离测试手段．仍可以使专属性得到大大改善。因此当体内药物浓度达到比μg／ml水平且能采取正确、合理的分离手段时，分光光度法仍然是一个可行的、较好的测定方法。 原理： 紫外—可见分光光度法的定量依据是Beer—Lambert定律。A＝-1gT＝ECL,由此看出，吸收度与浓度(C)或液层厚(L)成正比关系，当溶液浓度C一定时，A与E成正比. 因此在定量分析中，尽可能选E值较大的波长处测定以提高测定的灵敏度，如果溶液中同时存在两种或两种以上吸光物质时，只要共存物不互相影响也不改变各自本身的吸收系数，则溶液的吸收度是各组分吸收度的加和，各组分的吸收度由各自的浓度与吸收系数所决定。 物质对光吸收的加和性是测定混合组分的依据。当溶液中有干扰测定的物质存在时，如不采用特殊测定技术将干扰组分消除，就必须采取分离手段消除干扰，否则无法得出被测药物的准确含量。 常用样本处理方法： 液-液萃取 ：血液中的一些成分常在250一270nm有吸收，如不经处理会对测定造成干扰，因此在测定前应采用必要的分离技术消除干扰。液—液萃取技术在分光光度法中应用较多，根据样品中干扰物质的多少及所用有机溶剂分离能力的强弱，可采用一次或二次提取的方法。 一般情况下二次萃取的回收率较一次萃取低，但样本净化好，并可以通过调节测定液的pH值改变被测物的吸收光谱，使之避开干扰，所以二次萃取的方法在HPLC上及GC法中相对运用较少，而在紫外-可见分光光度法中相对应用较多。 在应用紫外—可见分光光度法测定体内药物分析时究竟采用一次提取还是二次提取，应根据被测药物浓度、所用有机溶剂提取能力的强弱、分析方法的专属性等全面考虑。 萃取后化学衍生化：前面曾提到分光光度法不具备分离能力、在休内药物的测定中如采用化学衍生化技术可以改变被测物的结构并使光谱发生变化，避开内源性物质的干扰，提高测定方法的专属性、准确性及灵敏度。 固相萃取：20世纪70年代初开始应用，样本制备时间短、所需样本量少、不会发生乳化且便于自动化操作，所以近几年发展很快。 举例：固相萃取-紫外导数光谱法测定生物检材中安眠酮含量 仪器：日本岛律—250型紫外—可见分光光度计 方法：取组织匀浆1g，2次各加6％高氯酸5m1，振摇，离心，倾出并合并上清液。取用甲醇洗去杂质后烘干的GDX403微球50mg，加甲醇约0.3ml活化后加入上清液中，振荡30min后将微球滤集于15×0.5cm的层析柱中，用水30m1淋洗后用二氯甲烷7mL洗脱，洗脱液置沸水浴上蒸至近干，残留物用0.1mol/L的盐酸4ml溶解，测定溶液的二阶导数光谱。 计算分光光度法 等吸收双波长消去法： 原理：由于物质对光的吸收呈加和性，当测定混合物时，如能在干扰物的光谱上选择吸收度相等的两波长λ1和λ2，则在λ1和λ2处测得的干扰物的吸收度差值△A=0；由于被测物在所选的两波长处吸收度不等于零，因此在这两波长处测得的吸收度差值△A只与被测物浓度成正比。应用等吸收双波长消去法时，注意要求干扰物在所选的两波长处吸收度相等，而被测物在这两波长处的△A值足够大，这样才能有较大的测定灵敏度。 举例：双波长紫外分光光度法测定氨茶碱血药浓度 　 取空白血清及含茶碱15μg／m1的血清各0. 5 m l, 按样品处理方法操作, 提取液在分光光度计上扫描得各自的图谱, 从图谱上看出,在274 nm 处,茶碱有最大吸收, 空白血清提取液也有吸收, 对测定结果有干扰。经测定空白血清在274nm 与298 nm 处的吸收基本相等, 同时A = A 274-A 298与血清中茶碱有良好的线性关系, 因此用双波长紫外分光光度法测定血中茶碱浓度, 可消除空白血清的干扰。 导数光谱法： 所谓导数光谱是吸收度关于波长λ的一阶或多阶微分对波长的函数。 为了与经典的紫外分光光度法区别，我们把以吸收度为横坐标．波长为纵坐标作图得到的光谱称为零阶光谱，把以吸收度的变化(dA)对波长变化(dλ)的变化率(dA／dλ)对波长λ作图得到的图谱称为一阶导数光谱，以此类推可得到更高阶数的导数光谱。随着导数阶数的增高，峰的个数也增多，而且峰形更尖锐，原函数上的一些特征，如极值点(峰或谷)、拐点等在各阶导数图像上都有相对应的更明确的显示，因此导数光谱可以提高分辨能力。 根据光的吸收定律：A＝εCL，一阶导数dA／dλ＝dε／dλ·C·L 二阶导数d2A／dλ2＝d2ε／dλ2·c·L，依次类推，在任