实验细胞融合.pptVIP

* * B 淋 巴 细 胞 杂 交 实验四 杂交的目的----- 制备单克隆抗体 杂交瘤技术的基本原理 具有分泌功能的B细胞难以在体外长期存活。利用细 胞融合技术，将免疫后的B细胞与在体外能长期存活的 骨髓瘤细胞进行融合，经过选择培养获取杂交细胞， 这种细胞称为杂交瘤细胞（Hybridoma）。 ※：该细胞的特点： 1、具有免疫B淋巴细胞分泌特异性mAb的功能； 2、具有骨髓瘤细胞无限增殖的能力。故应用杂交瘤 细胞生产单克隆抗体。 杂交瘤技术基本过程示意图 HAT选择性培养 HAT分别代表次黄嘌呤（hypoxanthine，H）氨基碟呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶（thymidine, T）三 种物质。 细胞的DNA生物合成有两条途径： Choice of animal The mouse is usually the animal of choice. Suitable mouse myeloma cell lines are widely available, and grown of hybridomas in mice is usually no problem. All of the currently available mouse myeloma lines, which are suitable for fusion, are of BALB/C origin, 6-8 week, female mouse is usually used . Choice of myeloma cell 1. NS-1, has been very widely used for hybridoma production. When cultured alone, it synthesizes κ light chains. 2. X63 and Sp2/0 are the current lines for fusion . Sp2/0 hybridoma appear to be somewhat more Sensitive than NS-1 to environmental conditions. Fusing agent All current hybridoma work uses polyethylene glycol (PEG) as the fusing agent. The exact molecular weight PEG seems to be unimportant. Most investigators have used PEG of molecular weight 500-6000. Note that the number assigned to PEG does not necessarily indicate its molecular weight. concentration of PEG range from 30% to 50%. Below 30%, the fusion frequency is low, and above 50%, toxicity becomes overwhelming. 动物免疫 一、可溶性抗原 1wk 抗原50μg /只，溶于300μl 生理盐水中， 加入等量福氏完全佐剂（CFA）充分乳化， 分颈、部皮下多点及腹腔注射； 3wk 抗原的剂量及注射的部位同上，仅将全佐 改为半佐（IFA）； 5wk 抗原50μg /只，溶于300μl 生理盐水中， 腹腔注射； 加强 融合前3~5天 抗原20~30μg /只，溶于 50μl 生理盐水中，小鼠尾静脉注射以加 强免疫。 二、细胞抗原 1wk 细胞数量8×106个/只，洗涤三遍，用0.3~0.4ml的生理 盐水重新悬浮，腹腔注射； 3wk 细胞数量6×106个 /只，细胞的预处理及注射的部位同上； 5wk 细胞数量5×106个 /只，细胞的预处理及注射的部位同上； 加强 融合前的4