第六讲pcr技术及其应用.pptVIP

* PCR技术的基本原理 PCR的反应动力学　 PCR反应最终的DNA 扩增量,Y＝(1＋X)n Y:DNA片段扩增后的拷贝数 X:每次扩增效率的平均值 n:循环次数。 平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。 平台期(Plateau) 反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期 产生的因素: ①dNTP和引物浓度下降 ②酶与模板的比例下降，能参与反应的酶分子数下降 ③多次循环后酶与dNTP的稳定性下降 ④非特异产物及引物二聚体比例增加 ⑤产物浓度高时变性不完全，影响引物的延伸，产物浓度过高10－8M时，降低Taq酶的延伸与加工能力。 大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。PCR反应应在平台期前结束。 PCR扩增产物 　 长产物片段和短产物片段 短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5‘端之间，是需要扩增的特定片段。 短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成. 在一个反应周期中， 以两条互补的DNA为模板，引物是从3‘端开始延伸， 其5’端是固定的，3‘ 端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。 第二周