免疫组化染色的常见问题和定量分析课件.ppt

免疫组化染色的常见问题和定量分析;免疫组化原理和方法;概念：;原理： ;一抗的类别;显示剂 ;底物;免疫组化的优点 ;免疫组化技术操作上的优点;免疫组化染色的缺点;步骤;染色中各步骤注意事项及原理; 前期 ;染色过程中的影响因素; 内源性HRP的消除;内源性HRP的消除:;抗原修复 ;抗原修复方法 ;化学方法;二.胃蛋白酶(Pepsin)消化方法 1.配制：0.4％胃蛋白酶，用0.1mol/L的Hcl配制。 2.消化时间：37℃20 min。 3.用途：主要用于细胞间质抗原的显示，如纤粘素、胶原酶等 ;三．链霉蛋白酶消化方法 四．无花果蛋白酶消化方法 五. 菠萝蛋白酶消化方法 六．尿素消化方法 ;物理／化学方法 ; 高压锅免疫组化抗原修复程序;柠核酸盐缓冲液的配制 ;抗体的保存和配制;抗体的保存;分装 ;即用型抗体 ;抗体的配制 ;其他准备工作中的注意事项; 免疫组化染色不理想的处理;;;; 非特异性染色的消除;修改封闭方法;DAB显色过程中的问题;抗原的“例外”表达 ;出现背景着色的其他几种原因 ;染色背景过深的处理;特异性差的处理;假阳性的原因 ;假阴性的原因 ;阴性染色的处理; 注意： 整个操作过程中注意一定要避免干片！！！ 免疫组化的精髓是低浓度，长时间！！！;复染 ;;分色的问题;封片的问题;; 对照; 结果判断;;;;判定标准 ;乳腺癌Her2染色结果判读 ;罗氏公司VENTANA HER2判读指南;切片的观察;贴签 ; ;;;;; 1、精确 其切割精度可达1个微米, 完全可以胜任染色体级别的切割操作,是同类产品中唯一可以切割染色体的系统。 2、安全 由于采用了337纳米的安全紫外激光,不会对生物样本造成损害和变异, 同时避免了红外光的热效应。 ; 3、高纯度 采用了PALM公司的LPC (激光弹射收集）技术, 对目标先进行切割, 然后发射一个激光脉冲, 把目标向上弹射, 进入收集装置。整个过程简单, 没有任何机械接触, 无污染, 不需要特殊耗材。 4、人性化操作 一个好的工具在操作上应该是简单合理的。PALM通过一个智能化软件PALM Robot可以完成所有的切割工作, 也就是说所有的工作都用鼠标完成。一个熟练的操作者完成一个操作只需要几十秒的时间。 ; 5、灵活 PALM的操作可以将整个片子上所有感兴趣的区域标记出来, 然后点击切割按钮, 从切割到收集一切工作可以自动完成。此外还可以用不同颜色标记出不同种类的细胞, 软件会自动分次收集同类细胞。可以自动计算出每个区域的面积。所有的区域都可以以文件的形式储存在电脑中, 配合上位置记忆功能, 这样同一张片子在任何时候都可以拿出来进行分析, 而无需进行繁琐的重复性劳动。可以随时将屏幕上的画面存档。可以用快捷键或鼠标随时调节激光的能量和聚焦位置。 ;激光显微切割的缺点;激光显微切割技术的应用 ; DNA分析 ; 基因表达分析 ; 单细胞分析 ;A;冰冻切片的制作及其注意事项;冰冻切片;用途;冰冻切片的优点： ;冰冻切片的缺点 ;组织冰冻切片OCT包埋剂 ;骤冷剂 ;切片前准备;切片完成后冰冻机的处理;切片机的使用 ;Thanks