114第十一章遗传物质的分子基础.pptVIP

粘粒（cosmid）载体（45kb） 细菌人工染色体BAC（300kb）bacterial artificial chromosome 酵母菌人工染色体YAC（1Mb）yeast artificial chromosome Ti质粒 Ti质粒是根癌农杆菌的染色体外遗传物质 双链闭合环状DNA，150～200kb 植物基因工程常用的载体 Ti质粒结构 T-DNA Transfer DNA 是农杆菌侵入植物细胞时从Ti质粒上转移到植物细胞的一段DNA T-DNA两端个有一段25bp的同向重复序列，是T-DNA的边缘区 LB；RB 在同一条单链的LB和RB内各形成一个缺口，单链T-DNA进入植物细胞 三. 基因的分离与鉴定 从基因库中分离基因 聚合酶链式反应(PCR)扩增基因 人工合成基因 T－DNA标签法 (一)从基因库中分离基因 1．构建基因库 2．筛选基因库 3．阳性克隆的分析与鉴定 1．构建基因库 基因库 (library)是一组DNA或cDNA序列克隆的集合体。 创建基因文库的目的是从特定的材料中分离目的DNA片段或基因。 把所有的基因集中在一个库中，采用一定的方法在库中筛选目的基因。 同时也便于基因的长期保存。 基因组文库 Genomic DNA library 使用与切割载体相同的限制酶，将供体生物的基因组DNA切割成许多片段 将所有片段连接到载体上，构成一个重组DNA群体 这个群体包含全基因组的遗传信息 cDNA文库 cDNA library 以mRNA为模板，经反转录酶合成互补DNA(complementary DNA，cDNA) 将双链cDNA与适当载体连接 转化到宿主细胞内进行扩增，建成cDNA文库 基因组文库与 cDNA文库的比较： 基因组文库包含基因组的所有基因 cDNA文库只包括某一特定细胞类型、某一组织、或某一发育时期的表达序列 分离特定基因，cDNA库比较方便 研究调控序列，必须基因组文库 从基因库中筛选特定的克隆 一个基因文库中有几万个克隆，目的基因到底在哪个克隆上呢？ 根据待选基因相关信息 确定筛选方法和条件。 最常用的方法是利用一段核苷酸序列作探针，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，筛选基因库 DNA探针（probe） 探针是一段能够与待选目的基因互补的核酸序列 DNA、cDNA、寡聚核苷酸 单链、双链 同位素标记、荧光标记、颜色标记 筛选文库 质粒基因库筛选 细菌混合液在培养在平板上 转移到尼龙膜上 裂解细菌 变性DNA 标记探针 杂交 漂洗 放射自显影或荧光检测 挑取对应菌落、培养 抽提质粒 阳性克隆的分析与鉴定 从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步分析、鉴定，才能最后得到目的基因 测序 自动测序仪 功能分析 预测软件 (二)聚合酶链式反应(PCR)扩增基因 利用PCR方法可以在数小时内使目的DNA片段扩增到数百万个拷贝。 基本原理： 根据待扩增基因的部分序列合成成对引物，在体外合成两个引物之间的DNA序列。 聚合酶链式反应(PCR，polymerase chain reaction) PCR方法已成为分子生物学研究常规手段 而且还用于遗传、发育、进化、疾病诊断、法医学等领域 PCR技术的发明是现代生物学发展史上的又一个里程碑 发明人获得了1993年诺贝尔化学奖 （三） 人工合成基因 根据已知的基因序列，或根据氨基酸序列推测DNA序列 将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成DNA的方法结合起来，可以很快地人工合成基因。 （四） T－DNA标签克隆基因 利用T－DNA插入创造突变体 获得突变体的纯合材料 分析突变体性状与T－DNA的共分离关系 PCR获得T－DNA的侧翼基因组序列 用所得序列作探针筛选基因文库，获得目标基因或克隆 再作进一步的分析 三、重组DNA分子的构建 用相同的内切酶酶解目的基因与载体 将载体与目的基因混合 用DNA ligase连接 重组DNA分子的构建 四、 外源基因导入宿主细胞 将目的基因与载体连接，构建重组DNA分子 重组DNA分子必须导入宿主细胞才能扩增或表达 1.重组DNA导入原核生物 原核生物基因工程的受体通常是大肠杆菌 导入方式多用转化法 也有用结合的方法 2.重组DNA导入植物 （1）、根癌农杆菌转化技术 （2）、基因枪法 根癌农杆菌转化技术 根癌农杆菌 （Agrobacterium tumefaciens) 根癌农杆菌介导的植物转化是应用得最早而广泛的一种植物转化方法。 双子叶植物、单子叶植物都可以用。 将目的基因与花椰菜花叶病毒35S启动子及终止子组成嵌合DNA分