Western blot详细操作过程.docxVIP

Western Blot Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄（NC）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。 流程：蛋白样品的提取→蛋白样品定量与变性→PAGE凝胶电泳→转膜→丽春红染色→封闭→抗体孵育→底物显色。 实验器材和试剂： 蛋白提取试剂 1.10% SDS裂解液： 称取10g SDS粉末加入双蒸水至90mL，充分溶解，定容至100ml室温保存。 2.RIPA裂解液 1ml裂解液工作液配方： 10ul 100mmol/L PMSF (1mM) 0.2ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml) 试剂盒RIPA 试剂盒RIPA 0.9848ml 裂解液 0.5ml裂解液工作液配方： 5ul 100mmol/L PMSF (1mM) 0.1ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml) 2.5ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/ml) 0.4924ml 裂解液 PMSF必须摇匀至无结晶时才可与裂解液混合 3．蛋白酶抑制剂：100mmol/L PMSF： 17.4mg PMSF粉末溶于1ml异丙醇(AR)，分装250ul每管后－20℃保存。使用终浓度为1 mmol/L。【PMSF：在溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂解液中。PMSF剧毒，严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量的水冲洗。凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。】 蛋白定量试剂： BCA蛋白定量试剂盒 10ml 0.9%的生理盐水（90mg NaCl溶于10ml去离子水中） 上样用试剂： 6×SDS上样缓冲液： 取一个离心管，秤取2.0g SDS粉末，6mg溴酚蓝(BromopHenolblue;Albutest)粉末，然后用枪头加入5mL 1.5mol/L Tris-HCl (pH 6.8)，用移液管加入10mL Glycerol(甘油，丙三醇)，枪头加入2mL β-mercapteethanol（β-巯基乙醇）充分混匀，加双蒸水定容至20ml，涡旋溶解。4℃避光保存。 电泳工作液： 1.5mol/L Tris-HCl缓冲液：（三（羟甲基）氨基甲烷） 称取18.171g Tris粉末，加入60mL 双蒸水中，加盐酸调节pH至6.8或8.8，定容至100mL。4℃保存。可致癌，不要直接接触皮肤。 1.0mol/L Tris-HCl缓冲液： 称取12.114g Tris粉末，加入60mL 双蒸水中，加盐酸调节pH至6.8或8.8，定容至100mL。4℃保存。可致癌，不要直接接触皮肤。 0.5mol/L Tris-HCl缓冲液： 称取6.057g Tris粉末，加入60mL 双蒸水中，加盐酸调节pH至6.8或8.8，定容至100mL。4℃保存。可致癌，不要直接接触皮肤。 4.10% APS：(一周内使用，最好新鲜配置) 称取0.5g APS粉末，加入双蒸水至5 mL，充分溶解，4℃保存。 5.10% SDS: 秤取10g SDS粉末溶于100ml双蒸水中，可50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用 5.分离胶（下层胶）： 分离胶 5% 7.5% 10% 12% 15% 30% acrylamide/bis 1.68ml 2.5ml 3.35ml 4.02ml 5ml 1.5mol/L Tris-HCl (pH 8.8) 2.5ml 2.5ml 2.5ml 2.5ml 2.5ml 10% SDS 100ul 100ul 100ul 100ul 100ul DdH2O 5.47 4.65ml 3.8ml 3.13ml 2.15ml 10%APS（灌胶时再加） 50μL 50μL 50μL 50μL 50μL TEMED（灌胶时再加） 5ul 5ul 5ul 5ul 5ul 分离蛋白分子量 57-212KD 36-94KD 20-80KD 12-60KD 10