4-1 动物基因工程(简).pdfVIP

动物基因工程技术 主要内容 第一节 基因工程的操作步骤 第二节 海洋动物基因工程 基因工程(Gene Engineering)的定义: 狭义上：按照人们的愿望、通过体外DNA重 组和基因的转移，有目的地改造生物物种的 特性。 特点：突破了生物物种的界限。 广义上：DNA重组技术的产业化设计与 应用，包括上游技术和下游技术两大部分 （倾向于工程学的范畴）。 上游技术指外源基因重组、克隆和表达的 设计与构建（即狭义的基因工程）。  下游技术则涉及到含有重组外源基因的生 物细胞的大规模培养以及外源基因表达产 物的分离纯化过程。 基因工程是生物技术的核心部分。 开展基因工程的四大要素或四个基本条件： 工具酶、基因、载体、受体细胞 第一节 基因工程的操作步骤 （一）获取目的基因 （二）构建重组DNA 分子 （三）将重组DNA 引入受体细胞 （四）阳性重组体的筛选与鉴定 （五）目的基因的表达及 蛋白质产物的分离纯化 基因工程的操作步骤之一：获取目的基因 目的基因是人们需要的基因，也是接受目的基因的细胞或 个体原本没有的基因。 获 获取目的基因的主要方法有： 1.化学合成：对于序列已知、长度较小的基因，扩增的方法也 可采用化学法。 2. 印迹法：从基因文库中把目的基因“钓”出来。 3. PCR技术：利用聚合酶链式反应(PCR)可以在体外很快 将DNA 反复甚至是无休止地复制。 内切酶切开DNA 电泳 DNA变性 印迹转移 放射性探针杂交 洗去未杂交游离探针 胶片显影 印 迹 法 印迹法的关键是 “分子杂交”，利用 碱基配对的原则，用一段小的已知的 DNA 片断去寻找 （“钓”）大的未知的 基因片断。 探针DNA 片断从何而来？ 根据目的蛋白的氨基酸序列，只要其 中N －端15 －20 个氨基酸序列，按三 联密码转为40-60 核苷酸序列，人工合 成，即为探针DNA 片断。 用上面的方法 “钓”出的目的基因， 数量极少，所以，接下来必须经过扩 增，亦称为基因克隆。获得相当数量 的目的基因后，才能继续下一步操作。 获取目的基因之方法3: PCR技术 PCR (Polymerase chain reaction) ， 又称多聚酶链式反应，是近年来开发 出来的基因工程新技术，它的最大优 点是把目的基因的寻找和扩增，放在 一个步骤里完成。可以在体外很快将 DNA反复甚至是无休止地复制。 PCR原理示意图 模板DNA 变性 （一般94℃，30sec-1min） 退火 （一般45-65℃，30sec-1min） 引物延伸 （一般70-72℃，30sec-2min ） 第二次循环 模板变性、退火 延伸 经25-30次循环，目的 DNA增加106-7 PCR反应的成分 反应体系一般为50-100μl 如50ul反应液 • 反应缓冲液(10 ×) ：5ul •4种底物(dATP+dCTP+dGTP+dTTP，2.5mM/each) : 4ul •2个引物：1ul (终浓度0.2-1uM) •模板DNA: 1ul • DNA聚合酶(5 units/ul): 0.3ul • 灭菌DDW: 38.7ul DNA 测序峰形图 基因工程的操作步骤之（二） （一）获取目的基因 （二）构建重组DNA 分子 （三）将重组DNA 引入受体细胞 （四）阳性重组体的筛选与鉴