实验二：细菌涂片的制备和染色镜检1.ppt

细菌染色的目的意义： 细菌菌体微小、而且折光率低，在显微镜下特别是在油浸物镜下几乎与背景无反差，很难看清楚，如将其染色，使折光率增大，便容易观察。由于菌体的性质及各部分对某些染料的着色性不同，因此可以利用不同的染色方法来区别不同的细菌及其结构。 染色剂分类： 碱性染色剂：（电离后分子带正电荷）；碱性染色剂主要用于 染核和异染颗粒等细胞结构。 酸性染色剂：（电离后分子带负电荷）；酸性染色剂主要用于 染细胞质。 复合染色剂：（在电离后分子不带电荷，故也称为中性染色 剂）；复合染色剂主要用来染螺旋体和立克次 体。 涂片染色程序：涂片 自然干燥 固定 染色干燥 镜检 细菌涂片示例： 实验内容： 1、? 细菌抹片的制备： 玻片准备：透明、洁净、无油渍。 抹片：液体材料、非液体材料、组织脏器材料的抹片方法讲解、示范。 干燥固定：火焰固定和化学固定的示范。讲解其目的及注意事项。 2、? 细菌涂片的制备：讲解并示范涂片、干燥、固定的方法。 3、? 细菌常用染色方法：革兰氏染色法 革兰氏染色法：1. 制片：取待检病料或细菌培养物常规抹（涂）片、干燥、固定。 2. 初染：滴加结晶紫，染色1-2分钟，水洗。 3. 媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1分钟，水洗。 4. 脱色：用滤纸吸取或甩去载玻片上的残水，将载玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时（20—30秒），立即水洗。 5.复染：用复红液复染约2分钟，水洗。6. 镜检：用滤纸吸水，干燥后，显微镜油镜观察。 革兰染色步骤 革兰染色时注意事项：1、要用幼龄培养物作革兰染色；2、涂片不宜太厚，以免脱色不完全造成假阳性 革兰阳性菌：细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性降低，结晶紫与碘形成的大分子复合物保留在细胞内而不被脱色，结果使细胞呈现紫色。革兰阴性菌：细胞壁肽聚糖层薄，网状结构交联少，类脂含量较高， 经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，因而细菌细胞被脱色，再经石炭酸复红复染后细胞呈红色。 革兰氏染色法原理： 革兰氏染色法将细菌分为G＋和G- ，这由两类细菌细胞壁的结构和组成的不同而决定。用结晶紫初染后，所有的细菌都染上蓝紫色。碘作为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫-碘的复合物，增强了染料与菌体的结合力。用乙醇脱色处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。G＋细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，且壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色时使细胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降低，使得结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内。虽经洗脱和复染仍然保持初染剂的蓝紫色。G-细菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以在脱色处理时，类脂被乙醇溶解，细胞壁的通透性增大，使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的颜色。 细菌形态与结构检查法 显微镜放大法——细菌形体微小，肉眼不能直接看到，必须借助显微镜（普通光学显微镜、电子显微镜）放大后才能观察。 染色法——细菌体小半透明，经染色后才能观察较清楚。 普通光学显微镜的分辨率为0.25um。一般细菌都大于0.25um，故可用普通光学显微镜观察。 电子显微镜的分辨率为1nm。不仅能看清细菌的外形，内部超微结构可一览无余。 细菌的大小与形态 观察细菌常用光学显微镜，其大小用测微尺在显微镜下进行测量，以微米(μm)为单位。不同种类的细菌大小不一，同一种细菌也因菌龄和环境因素的影响而有差异。 细菌按其外形，主要有 球菌(coccus) 球菌(coccus) 球菌(coccus) 球菌(coccus) 球菌(coccus) 杆菌(bacillus) 杆菌(bacillus) 杆菌的形态多样 杆菌(bacillus) 螺形菌(spiral bacterium) 特殊染色法 是对细菌特殊结构进行染色的方法。包括芽胞染色、荚膜染色、鞭毛染色等。 芽胞染色原理：细菌的芽孢壁比营养体的细胞壁结构复杂而且致密，透性低，着色和脱色都比营养体细胞困难。 方法：采用碱性染料微加热着染或延长染色时间，使营养体（菌体）和芽胞都着色后，再脱去营养体细胞的颜色而保留芽胞的颜色，再用其他颜色的染液着染营养体方法，并可在显微镜下区别。 孔雀石绿—沙黄法染色步骤 芽胞染色结果是：营养体染成红色，