凝胶迁移滞后实验 - 副本.docVIP

凝胶迁移滞后实验（electrophoretic?mobility?shift?assays，EMSA） 基本原理 凝胶迁移或电泳迁移率检测（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）是一种检测蛋白质和DNA序列相互结合的技术，最初用于研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用，可用于定性和定量分析。这一技术 目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。由于很多研究的TF不具有结合的特异性，所以即使发现TF和被研究的寡核苷酸探针结合，也不表示在体内该TF不能和其它寡核苷酸结合，运用一些生物信息学 软件，可以模拟表示TF与基因启动子区寡核苷酸结合的具体情况，发现TF可以和启动子区PUTATIVE 结合。同时，由于EMSA在体外不能模 拟细胞内众多生物分子的相互作用，比如，某一TF在细胞内由于受到其它TF的协同或者修饰后才能与寡核苷酸结合的话，那么在体外是不能重现这一结果的。03 年上一篇关于ChIP方法的介绍文献攻击EMSA 没有考虑细胞内完整自然的染色质结构和调节的影响而受到很大的限制！下面是在一个PROTOCAL1.探针的标记：(1) 如下设置探针标记的反应体系：待标记探针 (1.75pmol/微升) 2微升T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) 1微升Nuclease-Free Water 5微升[γ-32P]ATP(3,000Ci/mmol at 10mCi/ml) 1微升T4 Polynucleotide Kinase (5-10u/微升) 1微升总体积 10微升按照上述反应体系依次加入各种试 剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混匀。(2) 使用水浴或PCR仪，37℃反应10分钟。(3) 加入1微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。(4) 再加入89微升TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30％以上，即总放射性的30%以上标 记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。(5) 标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。2 . 探针的纯化：通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化，可以按照如 下步骤操作：(1) 对于100微升标记好的探针，加入1/4体积即25微升的5M醋酸铵，再加入2体积即200微升的无水乙醇，混匀。(2) 在-70℃至-80℃沉淀1小时，或在-20℃沉淀过夜。(3) 在4℃，12,000g-16,000g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉。(4) 在4℃，12,000g-16,000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。(5) 加入100微升TE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在 -20℃。3. EMSA 胶的配制：(1) 准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可 以选择可灌制较大 EMSA 胶的模具。(2) 按照如下配方配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。TBE buffer (10X) 1毫升重蒸水 16.2毫升39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v) 2毫升80% 甘油 625微升10% 过硫酸铵 (ammonium persulfate) 150微升TEMED 10微升(3) 按照上述次序加入各个溶液，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡， 并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。4.EMSA结合反应：(1) 如下设置EMSA结合反应(预期的结果参见图1)：阴性对照反应：Nuclease-Free Water 7微升EMSA/Gel- Shift结合缓冲液(5X) 2微升细胞核蛋白或纯化的转录因子 0微升标记好的探针 1微升总体积 10微升样品反应：Nuclease-Free Water 5微升EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) 2微升细 胞核蛋白或纯化的转录因子 2微升标记好的探针 1微升总体积 10微升探针冷竞争反应：Nuclease-Free Water 4微升EMSA/Gel-Shift结合