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蛋白质的分析法-蛋白质分析和研究技术 (7) 显色（development) 碱性磷酸酶(AKP)催化 BCIP （ 5-溴-4-氯-3吲哚磷酸） NBT （氮蓝四唑） 辣根过氧化物酶（HRP) DAB (3,3’-二氨基联苯胺） H2O2 棕色条带 * 蛋白质的分析法-蛋白质分析和研究技术 2、免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation) 免疫共沉淀方法通常用于测定两种目标蛋白能否在动物细胞体内结合产生相互作用，以及用于验证确定某种特定蛋白的新作用搭档。 思考题：免疫共沉淀与PULL DOWN的区别？ * 蛋白质的分析法-蛋白质分析和研究技术 免疫共沉淀示意图 * 蛋白质的分析法 蛋白质测序：用特异的蛋白酶或化学试剂将多肽切割成较小的肽段后，肽段可以在自动测序仪中利用Edman降解法（Edman degradation）从N端开始测序。通过不同特异性的蛋白酶切割产生的重叠片段的重排再现原始序列。 为了得到一个蛋白质序列而对其基因或互补DNA(cDNA)进行测序比对蛋白质测序要简单。 * X射线晶体学与核磁共振：许多蛋白质可以结晶，利用X射线衍射可以确定它们的三级结构。溶液中小分子质量的蛋白质结构可以通过多维核磁共振(multidimensional muclear magnetic resonance)来确定，尤其是正常的12C和14N被13C和15N取代后。 功能分析：对于一个蛋白质进行功能分析包括对它进行分离纯化，以及在突变体中由于基因突变或缺失而使蛋白质缺失，通过研究突变体的表现来研究蛋白质功能。有时也可通过将一个新蛋白的序列和结构与已知蛋白比较来预测它的功能。 蛋白质组学：在给定条件下对任何特定细胞类型的所有表达蛋白进行分析与鉴定即蛋白质组学。 蛋白质的分析法 * 还留下需要研究的问题，即在蛋白质分子内部氨基酸链是如何排列的。 镰刀型细胞贫血症，就是遗传物质DNA中一个CTT变成CAT，即其中一个碱基T变成A，以致产生病变。患者常有严重而剧烈的骨骼、关节和腹部疼痛的感觉. 在疟疾流行的地区，不利的镰刀型细胞基因突变可转变为有利于防止疟疾的流行。这一实例，也说明基因突变的有害性是相对的，在一定外界条件下，有害的突变基因可以转化为有利。 蛋白质的分析法-分离纯化前处理 细胞的破碎 分离提取某一生物大分子，首先要求生物大分子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢生物活性。因此应选择适当的方法将组织和细胞破碎。 若材料是体液或生物体分泌到体外的分泌物，则不必进行组织细胞的破碎。 * 1）机械法 通过机械切力作用使组织细胞破碎的方法， 如匀浆、研磨、捣碎。 高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约三分之一体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎。 此方法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少的动物脏器组织。 蛋白质的分析法-分离纯化前处理 细胞破碎方法： * 蛋白质的分析法-分离纯化前处理 玻璃匀浆器 * 2）物理法 通过各种物理因素作用使组织细胞破碎，如超声法、反复冻融法、冷热交替法、低渗裂解法。 超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂。 该方法多适用于微生物材料，例如用大肠杆菌制备各种酶。该方法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感的样品和核酸应慎用。 反复冻融法：将细胞在-20℃以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 蛋白质的分析法-分离纯化前处理 * 蛋白质的分析法-分离纯化前处理 超声波细胞破碎仪 * 3） 化学法 有机溶剂法：（丙酮）； 表面活性剂： SDS,Triton-100； 酶解法： 溶菌酶，蛋白酶等（较温和）。 蛋白质的分析法-分离纯化前处理 * 细胞器的分离