化学切割错配法.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 端粒序列的复制依赖于一种特殊的DNA聚合酶即端粒酶（telomerase）的作用。 端粒酶为由RNA和蛋白质组成的一种核糖核蛋白复合物（RNP），含有端粒重复序列的模板，即以自身RNA组分为模板，复制合成端粒序列。 熟悉 * 正常细胞周期中，细胞每分裂一次，端粒子链即缩短一次，经过若干分裂周期后，端粒缩短到临界长度时，细胞进入凋亡，端粒酶检测为阴性。 癌细胞在某些机制作用下，启动端粒酶表达而使染色体端粒稳定维持在一定长度，从而使癌细胞得以增殖，并获得永生化，此时端粒酶检测阳性。 熟悉 * 端粒的长度不能作为衡量端粒酶活性的可靠标记，而端粒酶活性表达的高低可作为恶性肿瘤发展的衡量指标。 端粒酶的表达水平有可能为肿瘤的发生发展、诊断、预后等提供指标，并有可能以抑制端粒酶表达为手段作为肿瘤治疗的新方法。 熟悉 * 二、端粒酶活性的检测 TRAP法 （telomeric repeat amplification protocal，TRAP） ELISA法 了解 * TRAP法 （telomeric repeat amplification protocal，TRAP） 首先从肿瘤细胞或组织中制备端粒酶提取液，然后进行TRAP反应，即在含有一条引物、dNTP和TRAP缓冲液的反应体系中，加入端粒酶提取液，使端粒以其RNA组分为模板催化合成端粒DNA重复序列，并以此为模板，加入另一条引物进行PCR扩增，扩增体系中加入标记的dATP（同位素、荧光素或地高辛等标记物），扩增产物可通过凝胶电泳、放射自显形（同位素为标记物）后分析，以荧光素为标记物者可通过扫描仪分析荧光曲线。应用地高辛标记试剂盒，还可进行半定量分析。 了解 * ELISA法 利用端粒酶在生物素标记的引物上加入多个6核苷酸端粒重复序列，反应产物用生物素标记的引物进行PCR扩增，再与链霉菌抗生物素蛋白包被的微量滴定板结合，与地高辛标记的探针杂交，产生的有色底物用酶标仪测量结果。 该法省时简便。 了解 * 结 语 * 分子诊断是具有划时代意义的检测手段，在生物医学领域中正发挥着巨大的作用，在肿瘤基础和临床研究中也显示了极大的优越性和应用前景。 * 分子诊断的任务不完全在于去寻找和发现新的理论、机制，更应致力于如何将实验研究成果转化到临床应用阶段。 * 需解决的问题如： 建立费用低廉、结果可靠、操作方便的分子诊断技术； 建立标准化的实验操作程序和标准化的分子诊断实验室，实现分子诊断标准化； 除了要在诊断技术方面逐步实行标准化外，对肿瘤诊断指标也要进行标准化。 * 随着人类基因组计划和后基因组（蛋白质组）计划的实施，分子诊断也将得到进一步完善和成熟，使人类最认清肿瘤的本质并攻克它。 * 相关技术参考文献 原位杂交 Herrington CS. Mol Pathol, 1998; 51: 8 Levy ER and Herrington CS. Oxford: Oxford University Press Inc, 1995: p25 ?荧光原位杂交 Water JJ. et al. Mol Pathol, 1998; 51: 62 Habeebu SSM, et al. Mol Biol Med, 1990; 7: 423 Southern blot Northern blot 许良中，实用肿瘤病理方法学。 上海：上海医科大学出版社，1997；p129 ?原位PCR Anderson V. Cell Vision, 1994; 1: 60 ?PCR-SSCP法 Sheffield VC, et al. Genomics, 1993; 16: 325 ?杂合双链分析法 White MB, et al Genomics, 1992; 12: 301 突变体富集PCR Boumforth KRV, et al. Mol Pathol, 1999; 52: 8 ?变性梯度凝胶电泳