时间分辨荧光免疫层析技术简介.ppt

 时间分辨荧光免疫层析技术简介 主要内容 免疫层析技术原理 1 工作问题机解决方案 免疫标记材料介绍 2 时间分辨荧光分析法 3 应用实例 4 免疫层析技术原理 免疫层析技术是建立在层析技术和抗原-抗体特异性免疫反应基础上的一项新兴免疫检测技术。 发展阶段： 初期：定性检测 新阶段：半定量、定量检测（信号放大、信号转换） 设计形式： 测向流层析 垂直流层析（渗滤法） 免疫层析技术原理 侧向流层析 固定相：固定有检测线和控制线的纤维层析材料（NC膜） 流动相：测试液 移动：毛细作用 结合：游离态待测物在固相捕获线处发生特异性免疫反应 图1 典型侧向流免疫层析试纸条构造（来源：Merck Estapor） 免疫层析技术原理 反应模式： 竞争法（小分子如药物、毒素） 夹心法（大分子如激素、菌体） 图2 免疫层析竞争法及夹心法反应原理图（来源：网络） 免疫层析标记材料 标记材料分类： 胶体金 胶体金 标记方法简单 金颗粒粒径1~100nm，与不同分子量的蛋白质结合比例不同 特异性强，适用范围广，可做多合一检测 物理吸附的结合方式易受pH值、离子强度等的影响 结果可视（消线法、比色法目测判读），对照比色卡或借助仪器可实现半定量检测 图3 胶体金检测试纸卡及读数仪（来源：勤邦生物） 纳米微粒 二氧化硅微球 粒径均一 100nm~10μm 理化性质稳定、抗紫外线、球形性好 密度较大、有一定本底、易吸附色素离子 乳胶微球 粒径均一 理化性质较稳定、球形性好 密度稍大于水 上述两种微球可制备成核-壳式结构，内部包埋染料、荧光物质或磁性物质，分别制成彩色荧光微球、有机荧光微球、时间分辨荧光微球、上转换磷光微球、超顺磁性微球等，其相应的生物-光电/磁信号转换-放大功能，为定量检测提供了依据；其外部可增加修饰不同密度、不同种类的官能团，通过化学偶联的方式结合蛋白等物质，从而使标记物更加稳定、检测灵敏度提升。 量子点（见后文） 图4 400x 放大的微米级聚苯乙烯微球 （来源：Bangslabs） 荧光(Fluorescence)：一种光致冷发光现象。荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量（发射光波长>入射光波长），停止入射光后发光现象也随即消失，具有这种性质的出射光就被称之为荧光。 发射光谱(Emission spectrum)：固定激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强度。 激发光谱(Exaction spectrum)：固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射强度。 斯托克斯位移(Stokes shift)：通常情况下荧光光谱较相应的吸收光谱红移，可用相同电子跃迁在吸收光谱和发射光谱中最强波长间的差值表示。 荧光材料 图5 荧光光谱图示例（来源：网络） 荧光效率(Fluorescence efficiency ) ：荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率，可用荧光强度占激发光强度的百分比表示。 荧光寿命(Fluorescence lifetime)：荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度所用的时间。 荧光猝灭(Fluorescence quenching)：荧光物质在某些理化因素（如紫外线照射、高温、某些硝基化合物、重氮化合物、重金属、卤素阴离子等）的作用下，激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射，从而导致荧光减弱甚至消退的现象。引起荧光猝灭的物质称为猝灭剂，常用于消除不需要的荧光。 荧光物质 最大吸收光谱 最大发射光谱 异硫氰酸荧光素 (FITC) 490～495nm 520～530nm（黄绿色） 四乙基罗丹明 (RB200) 570～575nm 595～600nm（橙红色） 四甲基异硫氰酸罗丹明 (TRITC) 550nm 620nm（橙红色） 藻红蛋白（PE） 490-560nm 595nm（红色） 7-氨基-4-甲基香豆素 354nm 430nm（蓝色） Alexa Fluor、CF Dye等新一代荧光染料系列 多种区段供选 铕（Eu3+）螯合物 340nm 613nm 表1 几种常见的荧光物质 荧光材料 优点： 普通荧光微球成本较低 光源与光电接收器不在同一直线上，激发光不直达检测器，荧光信号可量化范围大，提高分析灵敏度 显色多样，可满足多合一检测 不足： 不同材料需匹配不同光路系统 超微量分析中激发光及散射光可干扰结果 部分天然样本中存在本底干扰 荧光易淬灭，长期保存不稳定 图 6 荧光光度计光路革新设计（来源：ESEQuant） 普通荧光材料 优点： 荧光寿命长（Eu3+ 730μs，普通荧光基团 1-100μs，样本中蛋