总RNA提取和QPCR标准操作流程.docxVIP

总RNA提取及反转录标准操作流程 一、仪器试剂 Trizol试剂 三氯甲烷（4℃预冷） 异丙醇（4℃预冷） 75%乙醇（DEPC处理水配置）（4℃预冷） DEPC处理水/RNase free water（反转录试剂盒） 1.5mL无酶EP管 200μL无酶PCR管 冷冻离心机 Nano Drop 2000 反转录试剂盒（Takara RR036A） 二、实验须知 1. 选择人员走动较少的实验台或超净台（无须打开风机）操作。 2. 操作及观摩人员必须佩戴干净的一次性手套及口罩。 3. 尽可能在冰盘上操作。 3. 取EP管时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管后，袋子及时封好。 4. Trizol含剧毒，若溅到皮肤上，请立即用清水冲洗；若溅到眼内，立即大量清水冲洗，并送医就诊。 三、样品处理 1. 组织样品 将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解。 注1：样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。 注2：组织样品收取后应立即处理或液氮冷冻并-80摄氏度保藏。胰腺组织样品因其各种酶含量极其丰富，应尤为注意，研磨过程中注意保持样品低温状态。 2. 贴壁细胞样品 弃去细胞培养皿中培养基，根据下表加入适量 Trizol溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml 无酶EP管中，室温静置5min，使细胞充分裂解。