焦磷酸测序技术原理及应用.pdfVIP

焦磷酸测序 （Pyrosequencing ）技术 焦磷酸测序技术(pyrosequencing)是由Nyren等人于1987 年发展起来的一种新型的酶联级联测序技术，焦 磷酸测序法适于对已知的短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与SangerDNA 测序法相媲美，而速度 却大大的提高。焦磷酸测序技术产品具备同时对大量样品进行测序分析的能力，为大通量、低成本、适时、 快速、直观地进行DNA 甲基化、SNP等单个/连续多个核苷酸变异进行实时定量检测提供了非常理想的技 术操作平台。 一. 焦磷酸测序技术原理 焦磷酸测序技术是由4 种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。焦磷酸测序技术的原理是： 引物与模板DNA 退火后，在DNA 聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATPsulfurytase)．荧光素酶 (1uciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4 种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP 的聚合与一次荧 光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA 序列的目的。焦磷酸测序技术的 反应体系由反应底物、待测单链、测序引物和4 种酶构成。反应底物为5’-磷酰硫酸(adenosine- 5’-phosphosulfat，APS)、荧光素(1ucife