总RNA的提取和RT-PCR详解.ppt

采用takara cDNA Kit 合成cDNA第一链 按下列组分配制RT反应液 dNTP Mix (2.5mM Each) 4ml Primer Mix 1 ?l 5×primescript Buffer 4 ml DTT (0.1M) 2 ml HiFi-MMLV (200U/ml) 1 ml Total RNA 7 ml 反转录反应条件如下 42℃ 50min （反转录反应） 70℃ 15min （反转录酶失活反应） 注：反转录步骤在PCR仪中进行 * 第一链cDNA 2?l PerfectShot Taq(绿色) 10?l 上游引物 (10?M) 1?l 下游引物 (10?M) 1?l RNase free H2O 6?l 总体积 20?l 取0.2 ml PCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头)： 如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心，使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪(PCR仪)上 . PCR反应体系 * ① 94℃预变性5分钟后开始以下循环 ② 94℃ 30 秒 60℃ 30 秒 30 循环 72℃ 40 秒 ③ 72℃ 5 分钟 ④ 4 ℃ 保温 实验过程约1小时30分钟 PCR参数设置 * 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度 DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动. DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系). 琼脂糖凝胶电泳原理 * 影响迁移速率因素 1、 DNA的分子大小 2、 琼脂糖浓度 3、 DNA分子的构象 4、 电源电压 5、 嵌入染料的存在 6、 离子强度影响 琼脂糖凝胶电泳原理 * 实验材料 电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯晴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。 染料：Gelview、EB 电泳缓冲液：TBE 琼脂糖 DNA Marker 5000 * 含有分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测目的基因片段大小。 应选择在目标片段大小附近ladder较密的marker，这样对目标片段大小的估计较准确。 DNA Marker 实验材料 * 凝胶准备 胶床准备 铺胶 静置 胶床置于电泳槽中 加电泳缓冲液 拔梳子 上样 电泳 取出凝胶 拍照 实验步骤 * 本实验所扩增的产物DNA片段长度400bp～500bp, 可取5?l PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。利用标准DNA marker评估扩增的特异性。 琼脂糖凝胶电泳 * 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃，否则温度太高会使制板变形 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔 电泳前，确认样品孔位于电场负极； 点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多 Gelview有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔 紫外线照射不要太久 注意事项 * OD值(optical density)表示某一物质在某一个特定波长下的吸光度. 在分析化学里,某一化学物质都可吸收一定波长的光,并且对光的吸收度与这样化学物质的浓度成正比.因此可以利用吸光度的大小来测定某种物质的浓度. * * * 核酸为两性分子,在pH3.5时，整个分子带正电,pH8左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。 总RNA的提取、定量与RT-PCR * 完整RNA的提取和纯化,是进行RNA 方面的研究工作如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。 掌握从细胞中提取总RNA的方法 熟悉紫外吸收法检测RNA浓度与纯度的原理及测定方法 掌握RT-PCR基因扩增的原理和过程 目 的 * 实 验 流 程 提取原理 操作步骤 逆转录原理 操作步骤 提 取 总RNA