DB53_T 944-2019 甘蔗抗褐锈病基因Bru1的PCR检测技术规程.pdf

ICS 65.020 B 15 云 南 省 地 方 标 准 DB53/T 944—2019 甘蔗抗褐锈病基因 Bru1的PCR 检测技术规程 2019 - 09 - 23 发布 2019 - 12 - 23 实施 云南省市场监督管理局 发 布 DB53/T 944—2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1－2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由云南省农业科学院甘蔗研究所提出。 本标准由云南省农业标准化技术委员会（YNTC07）归口。 本标准起草单位：云南省农业科学院甘蔗研究所。 本标准主要起草人：王晓燕、李文凤、黄应昆、张荣跃、单红丽、仓晓燕、李婕、罗志明、尹炯。 I DB53/T 944—2019 甘蔗抗褐锈病基因 Bru1 的 PCR检测技术规程 1 范围 本标准规定了甘蔗抗褐锈病基因Bru1 PCR检测方法的原理、设备和器具、引物和试剂、操作步骤 及结果判定等。 本标准适用于甘蔗属及其杂交种抗褐锈病基因Bru1 的PCR检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文本。 2.1 甘蔗褐锈病 是指由黑顶柄锈菌（Puccinia melanocephala H. Sydow P. Sydow ）侵染引起的甘蔗病害。 2.2 Bru1 Bru1 是在甘蔗栽培品种‘R570 ’上发现和定位的第 1 个甘蔗抗褐锈病主效基因，被定位于甘蔗 第 7 条染色体的 0.42 cM 区域内，该基因对褐锈病菌具有广谱抗性。 3 原理 根据甘蔗抗褐锈病基因Bru1序列设计区域特异性引物，提取不同甘蔗品种/材料的总DNA ，对试样 进行PCR扩增，依据是否扩增获得预期大小的DNA及酶切片段来判断样品是否携带该抗病基因。 4 4 设备和器具 4.1 设备 电子天平（感量 0.01 g～0.0001 g）、涡旋混匀器、恒温水浴锅、台式离心机、PCR扩增仪、微波 炉、电泳槽、电泳仪、凝胶成像仪、-20 ℃冰箱、可调微量移液器。 4.2 器具 移液枪头、离心管、PCR管等，所有器具使用前需经高压蒸汽121 ℃灭菌30 min。 5 引物和试剂 5.1 基本要求 所有试剂均为分析纯，水为灭菌去离子水。 1 DB53/T 944—2019 5.2 PCR 引物 PCR 引物为： a) R12H16 标 记 ： 上 游 引 物 为 5′-CTACGATGAAACTACACCCTTGTC-3′ ， 下 游 引 物 为 5′-CTTATGTTAGCGTGACCTATGGTC-3′，预期扩增产物长度为570 bp 。 b) 9O20-F4 标 记 ： 上 游 引 物 为 5′-TACATAATTTTAGTGGCACTCA GC-3′， 下 游 引 物 为 5′-ACCATAATTCAATTCTGCAGGTAC-3′，扩增产物经Rsa I酶切后得到的预期产物长度为200 bp