脊灰病毒实验室监测.pptVIP

脊髓灰质炎病毒的实验室监测 河南CDC脊灰实验室 张明瑜 脊灰病毒病原学特征 属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属。病毒为直径30nm的小圆球型颗粒，无包膜。 有三个血清型，为I型、II型和III型，每个型别的脊灰都可致病。各型之间缺少交叉保护作用，三个血清型相对稳定，分别可用对应型的免疫血清做中和试验定型。 相对耐热、耐酸，也能抵抗许多普通的清洁剂和消毒剂，但在干燥、紫外线、高热、甲醛和游离氯作用下很易灭活 。 病毒在4℃下能存活数周，常温下能存活几天，-70°可存活数年。 脊灰病毒的传播 主要通过粪-口途径传播，近99%为隐性感染，但脊灰病毒通常持续2-4周随着感染者的粪便排出体外，而且可在外环境中存活较长时间。人是脊灰病毒的唯一天然宿主。 由于OPV常规免疫，疫苗相似株病例可在全国免疫日期间聚集发生。 脊灰病毒的致病性 主要侵犯人体脊髓灰质前角的灰、白质部分，对灰质造成永久损害，使这些神经支配的肌肉无力，出现肢体弛缓性麻痹。好发婴幼儿，故又称小儿麻痹症。本病可防难治，一旦引起肢体麻痹易成为终生残疾，甚至危及生命 。 中国在2000年通过了世界卫生组织西太区的无脊灰认证。 河南省在1992年4月19日，发现最后一例脊髓灰质炎野病毒病例。 实验室检测的重要性 实验室在确保达到消灭脊灰中的作用是至关重要的。除了脊灰病毒以外，还有其它因素也能引起急性弛缓性麻痹，因此所有疑似病例的标本都必须经过病毒学检测。因为只有0.1%~1%的感染者会出现临床症状，所以从每例确诊的AFP病例中采集到的粪便标本都必须按规定的程序进行认真检测，以防漏检脊灰野病毒，漏掉1例就意味着漏掉1000例脊灰病毒感染者。 实验室检测内容 细胞培养 脊灰病毒便标本的接收和处理及分离 脊灰病毒定型的中和试验 细胞培养 两种细胞系 细胞培养需要的试剂和材料 细胞培养的操作方法 两种细胞 1．L20B细胞，来源于转基因小鼠肺细胞，通过基因工程体外表达的方法使其表达人脊髓灰质炎病毒受体。该细胞对脊髓灰质炎病毒敏感，感染后产生特征性的肠道病毒致细胞病变（CPE）。 2．RD细胞，来源于人横纹肌肉瘤，该细胞对脊灰病毒、许多ECHO病毒和一些其它肠道病毒高度敏感，感染后产生特征性的肠道病毒CPE。 注意 如果RD细胞出现阳性结果而14天后L20B细胞仍然阴性，要在L20B细胞上续种一代，并且再观察7天以排除脊灰病毒存在的可能性。 除了肠道病毒外，含有一些其他病毒的粪便标本接种到L20B细胞上也会产生CPE（例如呼肠孤病毒和腺病毒）此时需如实记录CPE。一些非脊灰肠道病毒可以在肺细胞上产生CPE，因此也可以在L20B细胞上产生(但这些病毒产生的CPE通常与脊灰病毒产生的CPE明显不同）。这些标本也应该进行脊灰病毒定型实验以排除这些标本含有脊灰病毒的可能性。 细胞培养 两种细胞系 细胞培养需要的试剂和材料 细胞培养的操作方法 试剂和材料 生长液 不含钙离子和镁离子的PBS ….PBS(-) 长成单层的 RD 或 L20B 细胞 胰蛋白酶/EDTA PBS(-)稀释的 0.1% w/v 台盼兰 细胞计数板和盖玻片 细胞培养管和细胞培养瓶 吸管 吸尖 细胞培养 两种细胞系 细胞培养需要的试剂和材料 细胞培养的操作方法 操作方法 检查细胞的质量 用 PBS(-) 洗两次 用胰蛋白酶/EDTA消化细胞 在 36℃培养箱孵育 5 分钟 用生长液悬浮细胞并且计数 计算 传代至新的培养瓶 有关粪便标本注意事项 采集时间和采集份数 保存条件 运输条件 个案调查表的填写 采集时间和采集份数 麻痹14天内采集双份粪便标本，两份标本采集时间间隔24-48小时。 采集的粪便每份至少5-10克。 样品容器最好使用省级统一下发的采便盒，粪便盒上注明样品信息。 有关粪便标本注意事项 采集时间和采集份数 保存条件 运输条件 个案调查表的填写 保存条件 粪便标本采集后短时间可以4°C保存（冷藏包），长时间需要-20°C保存（冰箱/冰柜）。 有关粪便标本注意事项 采集时间和采集份数 保存条件 运输条件 个案调查表的填写 运输条件 有关粪便标本注意事项 采集时间和采集份数 保存条件 运输条件 个案调查表的填写 个案调查表和送检表 样品送往省级实验室同时要求附有个案调查表和送检表 调查表信息确保真实完整 脊灰病毒便标本的处理 粪便标本的处理必须在Class II生物安全柜(BSC)中进行。 除了肠道病毒外，含有一些其他病毒的粪便标本接种到L20B细胞上也会产生CPE（例如呼肠孤病毒和腺病毒）此时需如实记录CPE。一些非脊灰肠道病毒可以在肺细胞上产生CPE，因此也可以在L20B细胞上产生(但这些病毒产生的CPE通常与脊灰病毒产生的CPE明显不同）。这些标本也应该进行脊灰病毒